Caracterização do complexo genético tracrARN-DRARN associado ao sistema CRISPR-Cas9 do descritor de Acholeplasma palmae fitossimbionte: interesse biotecnológico

• Luis Moncayo Universidad Católica de Cuenca, Ecuador https://orcid.org/0000-0001-7511-0528
• Alex Castro Universidad Agraria de Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Ecuador https://orcid.org/0000-0003-4431-5293
• Diego Arcos Universidad Agraria de Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-7741-0978
• Paulo Centanaro Universidad Agraria de Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Ecuador https://orcid.org/0000-0001-7506-0444
• Diego Vaca Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-0799-3928
• Cristina Maldonado Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Babahoyo, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-5806-9508
• Aleivi Perez Laboratorio de Microbiología General, FEC-LUZ. Zulia, Maracaibo, Venezuela. https://orcid.org/0000-0003-2615-8917
• Carla Lossada Laboratorio de Caracterización Molecular y Biomolecular, Centro de Investigación y Tecnología de Materiales, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Zulia, Venezuela. 526 https://orcid.org/0000-0003-3346-7101
• Lenin González-Paz Laboratorio de Genética y Biología Molecular, FEC-LUZ. Zulia, Maracaibo, Venezuela Doctorado en Ciencias Agrarias, Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia, Zulia, Venezuela. https://orcid.org/0000-0003-0023-7342

Palavras-chave: acoplamento molecular, bioinformática, micoplasma, transativador

Resumo

A tecnologia CRISPR-Cas9 usada em biotecnologia vegetal é baseada no uso de nucleases Cas9 para gerar cortes precisos no genoma e um duplex composto de um RNA CRISPR transativador (tracrRNA) e um RNA CRISPR (_DRARN) que são precursores de o RNA guia comercialmente reprojetado (sgRNA) (sgRNA-Cas9) para guiar a clivagem do gene. A maioria dessas ferramentas vem de bactérias clínicas. No entanto, existem vários sistemas CRISPR-Cas9 em microrganismos ambientais, como fitoendossimbiontes do gênero Acholeplasma. Mas a exploração desses sistemas mais compatíveis com as plantas requer o uso de ferramentas de bioinformática para sua previsão e estudo. Os elementos associados ao duplex tracrARN-_DRARN em A. palmae foram identificados e caracterizados. Para isso, as informações sobre proteínas foram obtidas no Protein Data Bank e a genômica no GenBank / NCBI. O sistema CRISPR foi estudado com o software CRISPRfinder. Algoritmos de alinhamento e o software NUPACK foram utilizados para identificar os módulos tracrRNA e _DRARN, além de diversos softwares computacionais para caracterização genética, estrutural e biofísica. Um sistema CRISPR-Cas foi encontrado em A. palmae com características do tipo II-C, bem como um duplex com regiões flexíveis, termodinamicamente muito estável, apresentando uma energia de acoplamento termodinamicamente favorecida com Cas9. Esses resultados são desejáveis em sistemas de edição de genes programáveis e mostram a possibilidade de explorar ferramentas moleculares nativas em microrganismos ambientais aplicáveis à manipulação genética de plantas, à medida que mais pesquisas são realizadas. Este estudo representa o primeiro relatório sobre a estabilidade termodinâmica e acoplamento molecular de elementos associados ao duplex tracrRNA-_DRARN no fitossimbionte A. palmae.

Referências

Bae, S., Park, J., and Kim, J. S. 2014. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics, 30(10),1473-1475.
Baliga, P., M. Shekar and M. Nagarajappa. 2018. Investigation of direct repeats, spacers and proteins associated with clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) system of Vibrio parahaemolyticus. Mol Genet Genom, 294(1),253–262.
Belhaj, K., A. Chaparro-Garcia, S. Kamoun, N. Patron and V. Nekrasov. 2015. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr. Opin. Biotechnol., 32(1),76–84.
Benson, D. A., Cavanaugh, M., Clark, K., Karsch-Mizrachi, I., Ostell, J., Pruitt, K. D., and Sayers, E. W. 2018. GenBank. Nucleic Acids Res., 46(D1),D41-D47.
Bumgardner, E., W. Kittichotirat, R. Bumgarner and P. Lawrence. 2015. Comparative genomic analysis of seven Mycoplasma hyosynoviae strains. Microbiologyopen, 4(2),343-359.
Briner, A, P. Donohoue, A. Gomaa, K. Selle, E. Slorach, C. Nye and R. Barrangou. 2014. Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality. Mol. Cell, 56(2),333-339.
Briner, A., E. Henriksen and R. Barrangou. 2016. Prediction and validation of native and engineered Cas9 guide sequences. Cold Spring Harb. Protoc., 2016(7),pdb-prot086785.
Chylinski, K., A. Le Rhun and E. Charpentier. 2013. The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems. RNA Biology, 10(5),726-737.
Chyou, T. and C. Brown. 2019. Prediction and diversity of tracrRNAs from type II CRISPR-Cas systems. RNA Biology, 16(4),423-434.
Couvin, D., Bernheim, A., Toffano-Nioche, C., Touchon, M., Michalik, J., Néron, B., Rocha, E., Vergnaud, G., Gautheret, D. and Pourcel, C. 2018. CRISPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins. Nucleic Acids Res., 46(W1),W246-W251.
De Vos, W. 2017. Microbe Profile: Akkermansia muciniphila: a conserved intestinal symbiont that acts as the gatekeeper of our mucosa. Microbiology, 165(5),646-648.
Dupuis, N., E. Holmstrom and D. Nesbitt, D. 2014. Molecular-crowding effects on single-molecule RNA folding/unfolding thermodynamics and kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 111(23),8464-8469.
Høyland-Kroghsbo, N., K. Muñoz and B. Bassler, B. 2018. Temperature, by controlling growth rate, regulates CRISPR-Cas activity in Pseudomonas aeruginosa. mBio, 9(6),e02184-18.
Ipoutcha, T., Tsarmpopoulos, I., Talenton, V., Gaspin, C., Moisan, A., Walker, C. A., Brownlie, J., Blanchard, A., Thebault, P. and Sirand-Pugnet, P. 2019. Multiple origins and specific evolution of CRISPR/Cas9 systems in minimal bacteria (Mollicutes). Front. Microbiol., 10(2701),1-14.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., and Charpentier, E. 2012. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096),816-821.
Ka, D., Jang, D. M., Han, B. W., Bae, E. 2018. Molecular organization of the type II-A CRISPR adaptation module and its interaction with Cas9 via Csn2. Nucleic Acids Res., 46(18),9805-9815.
Kaushik, I., S. Ramachanrdan and S. Srivastava. 2019. CRISPR-Cas9: A multifaceted therapeutic strategy for cancer treatment. Semin. Cell Dev. Biol., 96(1),4-12.
Kunin, V., R. Sorek and P. Hugenholtz. 2007. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. Genome Biol., 8(4),R61.
Kube, M., C. Siewert, A. Migdoll, B. Duduk, S. Holz, R. Rabus and R. Reinhardt. 2014. Analysis of the Complete Genomes of Acholeplasma brassicae, A. palmae and A. laidlawii and their comparison to the obligate parasites from ‘Candidatus Phytoplasma'. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 24(1),19-36.
Lau, V. and J. Davie. 2017. The discovery and development of the CRISPR system in applications in genome manipulation. Biochem. Cell Biol., 95(2),203–210.
Makarova, K., D. Haft, R. Barrangou, S. Brouns, E. Charpentier, P. Horvath and J. Van Der Oost. 2011. Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems. Nat. Rev. Microbiol., 9(6),467-477.
Mirabelli, P., L. Coppola and M. Salvatore. 2019. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancer, 11(8),1098-1116.
Negahdaripour, M., N. Nezafat, N. Hajighahramani, S. Rahmatabadi and Y. Ghasemi. 2017. Investigating CRISPR-Cas systems in Clostridium botulinum via bioinformatics tools. Infection, Genet. Evol., 54(2),355-373.
Rodrigues, S. D., Karimi, M., Impens, L., Van Lerberge, E., Coussens, G., Aesaert, S., Rombaut, D., Holtappels, D., Ibrahim, H., Van Montagu, M., Wagemans, J., Jacobs, T., De Coninck, B. and Pauwels, L. 2021. Efficient CRISPR-mediated base editing in Agrobacterium spp. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 118(2),e2013338118.
São, C. 2018. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics, 7(2),29-32.
Shen, J., D. Zhao, R. Sasik, and J. Luebeck. 2017. Combinatorial CRISPR–Cas9 screens for de novo mapping of genetic interactions. Nat. Methods, 14(6),573-578.
Tully, J., R. Whitcomb, D. Rose, J. Bove, P. Carle, N. Somerson and S. Eden-Green. 1994. Acholeplasma brassicae sp. nov. and Acholeplasma palmae sp. nov., two non-sterol-requiring mollicutes from plant surfaces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 44(4),680-684.
Thomsen, R. and M. Christensen. 2006. MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. J. Med. Chem., 49(11),3315-3321.
Westra, E., A. Buckling and P. Fineran. 2014. CRISPR–Cas systems: beyond adaptive immunity. Nat. Rev. Microbiol., 12(5),317-326.
Yan, Y., D. Zhang, P. Zhou, B. Li, and S. Huang. 2017. HDOCK: a web server for protein–protein and protein–DNA/RNA docking based on a hybrid strategy. Nucleic Acids Res., 45(1),365-373.
Zhao, X., Z. Yu and Z. Xu. 2018. Study the features of 57 confirmed CRISPR loci in 38 strains of Staphylococcus aureus. Front. Microbiol., 9(1591),1-20.
Zhang, Y., A. Malzahn, S. Sretenovic and Y. Qi. 2019. The emerging and uncultivated potential of CRISPR technology in plant science. Nat. Plants, 5(1),778-794.