Caracterización del complejo genético tracrARN-DRARN asociado al sistema CRISPR-Cas9 del fitosimbionte Acholeplasma palmae descriptor: interés biotecnológico

Luis  Moncayo; Alex  Castro; Diego  Arcos; Paulo Centanaro; Diego  Vaca; Cristina  Maldonado; Aleivi  Perez; Carla  Lossada; Lenin  González-Paz

Luis Moncayo Universidad Católica de Cuenca, Ecuador https://orcid.org/0000-0001-7511-0528
Alex Castro Universidad Agraria de Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Ecuador https://orcid.org/0000-0003-4431-5293
Diego Arcos Universidad Agraria de Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-7741-0978
Paulo Centanaro Universidad Agraria de Ecuador, Facultad de Ciencias Agrarias, Ecuador https://orcid.org/0000-0001-7506-0444
Diego Vaca Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-0799-3928
Cristina Maldonado Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Babahoyo, Ecuador https://orcid.org/0000-0002-5806-9508
Aleivi Perez Laboratorio de Microbiología General, FEC-LUZ. Zulia, Maracaibo, Venezuela. https://orcid.org/0000-0003-2615-8917
Carla Lossada Laboratorio de Caracterización Molecular y Biomolecular, Centro de Investigación y Tecnología de Materiales, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Zulia, Venezuela. 526 https://orcid.org/0000-0003-3346-7101
Lenin González-Paz Laboratorio de Genética y Biología Molecular, FEC-LUZ. Zulia, Maracaibo, Venezuela Doctorado en Ciencias Agrarias, Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia, Zulia, Venezuela. https://orcid.org/0000-0003-0023-7342

Palabras clave: acoplamiento molecular, bioinformática, mycoplasma, transactivador

Resumen

La tecnología CRISPR-Cas9 usada en biotecnología vegetal se fundamenta en el empleo de nucleasas Cas9 para generar cortes precisos en el genoma y un dúplex conformado por un trans-activador CRISPR ARN (tracrARN) y un CRISPR ARN (_DRARN) los cuales son precursores del ARN guía (sgARN) rediseñado comercialmente (sgARN-Cas9) para guiar la escisión de genes. La mayoría de estas herramientas provienen de bacterias clínicas. Sin embargo, existen diversos sistemas CRISPR-Cas9 en microorganismos ambientales como los fitoendosimbiontes del género Acholeplasma. Pero la explotación de estos sistemas más compatibles con plantas requiere usar herramientas bioinformáticas para su predicción y estudio. Fueron identificados y caracterizados los elementos asociados al dúplex tracrARN-_DRARN en A. palmae. Para ello la información proteica se obtuvo del Protein Data Bank y la genómica del GenBank/NCBI. El sistema CRISPR fue estudiado con el software CRISPRfinder. Se utilizaron algoritmos de alineamiento y el software NUPACK para identificar los módulos tracrARN y _DRARN, y también diversos softwares computacionales para la caracterización genética, estructural y biofísica. Se encontró un sistema CRISPR-Cas en A. palmae con características de tipo II-C, así como un dúplex con regiones flexibles, termodinámicamente muy estable, presentando una energía de acoplamiento con Cas9 termodinámicamente favorecida. Estos resultados son deseables en sistemas de edición programable de genes y evidencian la posibilidad de explorar herramientas moleculares nativas en microorganismos ambientales aplicables a la manipulación genética de plantas, conforme se realicen más investigaciones. Este estudio representa el primer reporte sobre la estabilidad termodinámica y el acopamiento molecular de elementos asociados al dúplex tracrARN-_DRARN en el fitosimbionte A. palmae.

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Citas

Bae, S., Park, J., and Kim, J. S. 2014. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics, 30(10),1473-1475.
Baliga, P., M. Shekar and M. Nagarajappa. 2018. Investigation of direct repeats, spacers and proteins associated with clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) system of Vibrio parahaemolyticus. Mol Genet Genom, 294(1),253–262.
Belhaj, K., A. Chaparro-Garcia, S. Kamoun, N. Patron and V. Nekrasov. 2015. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr. Opin. Biotechnol., 32(1),76–84.
Benson, D. A., Cavanaugh, M., Clark, K., Karsch-Mizrachi, I., Ostell, J., Pruitt, K. D., and Sayers, E. W. 2018. GenBank. Nucleic Acids Res., 46(D1),D41-D47.
Bumgardner, E., W. Kittichotirat, R. Bumgarner and P. Lawrence. 2015. Comparative genomic analysis of seven Mycoplasma hyosynoviae strains. Microbiologyopen, 4(2),343-359.
Briner, A, P. Donohoue, A. Gomaa, K. Selle, E. Slorach, C. Nye and R. Barrangou. 2014. Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthogonality. Mol. Cell, 56(2),333-339.
Briner, A., E. Henriksen and R. Barrangou. 2016. Prediction and validation of native and engineered Cas9 guide sequences. Cold Spring Harb. Protoc., 2016(7),pdb-prot086785.
Chylinski, K., A. Le Rhun and E. Charpentier. 2013. The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems. RNA Biology, 10(5),726-737.
Chyou, T. and C. Brown. 2019. Prediction and diversity of tracrRNAs from type II CRISPR-Cas systems. RNA Biology, 16(4),423-434.
Couvin, D., Bernheim, A., Toffano-Nioche, C., Touchon, M., Michalik, J., Néron, B., Rocha, E., Vergnaud, G., Gautheret, D. and Pourcel, C. 2018. CRISPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins. Nucleic Acids Res., 46(W1),W246-W251.
De Vos, W. 2017. Microbe Profile: Akkermansia muciniphila: a conserved intestinal symbiont that acts as the gatekeeper of our mucosa. Microbiology, 165(5),646-648.
Dupuis, N., E. Holmstrom and D. Nesbitt, D. 2014. Molecular-crowding effects on single-molecule RNA folding/unfolding thermodynamics and kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 111(23),8464-8469.
Høyland-Kroghsbo, N., K. Muñoz and B. Bassler, B. 2018. Temperature, by controlling growth rate, regulates CRISPR-Cas activity in Pseudomonas aeruginosa. mBio, 9(6),e02184-18.
Ipoutcha, T., Tsarmpopoulos, I., Talenton, V., Gaspin, C., Moisan, A., Walker, C. A., Brownlie, J., Blanchard, A., Thebault, P. and Sirand-Pugnet, P. 2019. Multiple origins and specific evolution of CRISPR/Cas9 systems in minimal bacteria (Mollicutes). Front. Microbiol., 10(2701),1-14.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., and Charpentier, E. 2012. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096),816-821.
Ka, D., Jang, D. M., Han, B. W., Bae, E. 2018. Molecular organization of the type II-A CRISPR adaptation module and its interaction with Cas9 via Csn2. Nucleic Acids Res., 46(18),9805-9815.
Kaushik, I., S. Ramachanrdan and S. Srivastava. 2019. CRISPR-Cas9: A multifaceted therapeutic strategy for cancer treatment. Semin. Cell Dev. Biol., 96(1),4-12.
Kunin, V., R. Sorek and P. Hugenholtz. 2007. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. Genome Biol., 8(4),R61.
Kube, M., C. Siewert, A. Migdoll, B. Duduk, S. Holz, R. Rabus and R. Reinhardt. 2014. Analysis of the Complete Genomes of Acholeplasma brassicae, A. palmae and A. laidlawii and their comparison to the obligate parasites from ‘Candidatus Phytoplasma'. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 24(1),19-36.
Lau, V. and J. Davie. 2017. The discovery and development of the CRISPR system in applications in genome manipulation. Biochem. Cell Biol., 95(2),203–210.
Makarova, K., D. Haft, R. Barrangou, S. Brouns, E. Charpentier, P. Horvath and J. Van Der Oost. 2011. Evolution and classification of the CRISPR–Cas systems. Nat. Rev. Microbiol., 9(6),467-477.
Mirabelli, P., L. Coppola and M. Salvatore. 2019. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancer, 11(8),1098-1116.
Negahdaripour, M., N. Nezafat, N. Hajighahramani, S. Rahmatabadi and Y. Ghasemi. 2017. Investigating CRISPR-Cas systems in Clostridium botulinum via bioinformatics tools. Infection, Genet. Evol., 54(2),355-373.
Rodrigues, S. D., Karimi, M., Impens, L., Van Lerberge, E., Coussens, G., Aesaert, S., Rombaut, D., Holtappels, D., Ibrahim, H., Van Montagu, M., Wagemans, J., Jacobs, T., De Coninck, B. and Pauwels, L. 2021. Efficient CRISPR-mediated base editing in Agrobacterium spp. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 118(2),e2013338118.
São, C. 2018. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics, 7(2),29-32.
Shen, J., D. Zhao, R. Sasik, and J. Luebeck. 2017. Combinatorial CRISPR–Cas9 screens for de novo mapping of genetic interactions. Nat. Methods, 14(6),573-578.
Tully, J., R. Whitcomb, D. Rose, J. Bove, P. Carle, N. Somerson and S. Eden-Green. 1994. Acholeplasma brassicae sp. nov. and Acholeplasma palmae sp. nov., two non-sterol-requiring mollicutes from plant surfaces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 44(4),680-684.
Thomsen, R. and M. Christensen. 2006. MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. J. Med. Chem., 49(11),3315-3321.
Westra, E., A. Buckling and P. Fineran. 2014. CRISPR–Cas systems: beyond adaptive immunity. Nat. Rev. Microbiol., 12(5),317-326.
Yan, Y., D. Zhang, P. Zhou, B. Li, and S. Huang. 2017. HDOCK: a web server for protein–protein and protein–DNA/RNA docking based on a hybrid strategy. Nucleic Acids Res., 45(1),365-373.
Zhao, X., Z. Yu and Z. Xu. 2018. Study the features of 57 confirmed CRISPR loci in 38 strains of Staphylococcus aureus. Front. Microbiol., 9(1591),1-20.
Zhang, Y., A. Malzahn, S. Sretenovic and Y. Qi. 2019. The emerging and uncultivated potential of CRISPR technology in plant science. Nat. Plants, 5(1),778-794.