Optimización del proceso de exttracción de la lactasa de Kluyveromyces marxianus ATTC 8554, para su aplicabilidad en la industria láctea
Abstract
La lactasa o b-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima exclusivamente intracelular en Kluyveromyces marxianus ATCC 8554, por lo que para su liberación existen diversos métodos de extracción. El objetivo del presente trabajo consistió en optimizar el proceso de extracción de esta enzima para su uso en la industria láctea. La producción de la enzima fue inducida mediante el crecimiento de la levadura en un medio con lactosa como única fuente de carbono por 9 horas, donde alcanzó la fase logarítmica final de crecimiento. Se evaluó la combinación de los parámetros fisicoquímicos: temperaturas 30; 37 y 42°C; pH 6,5; 8,5 y 10 y tiempo 5; 10 y 20 horas con el método de extracción con tolueno al 2% en buffer fosfato 0,1M. Se determinó la actividad enzimática de la lactasa a través del uso de un sustrato cromógeno el o-nitrophenyl-b-D-galactopyranosido (ONPG) sobre los extractos libres de células. Se determinó la cantidad de proteínas totales por el método de Lowry, que permitió la valoración de la actividad específica. Los resultados fueron analizados empleando el paquete estadístico Statgraf versión 7,0, aplicando análisis de varianza trifactorial, LSD y prueba de Tukey. El análisis por microscopía electrónica de transmisión (MET) de las células de K. marxianus reveló que el tolueno ejerce un efecto permeabilizante, liberando la enzima sin ruptura de la integridad celular. Se encontró un acortamiento significativo (P < 0,01) en el tiempo necesario para la extracción de la lactasa, siendo la mejor combinación: 37°C, pH 6,5 y 5 horas, generando en este tiempo la mayor cantidad de ONP: 0,4937 µmoles/mL/10 min. y la mayor actividad específica 34,2095 Ub-gal/mg proteínas.
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