Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SARM) y productores de enterotoxina A aislados de portadores nasales asintomáticos entre estudiantes universitarios de México

Adame-Gómez Roberto1; Vences-Velázquez Amalia2; Parra-Rojas Isela3; Rodríguez-Bataz Elvia4; Muñoz-Barrios Salvador5; Ramírez- Peralta Arturo1

1. Laboratorio de Investigación en Patometabolismo Microbiano, Universidad Autónoma de Guerrero, Guerrero, México., Universidad Autónoma de Guerrero, Laboratorio de Investigación en Patometabolismo Microbiano, Universidad Autónoma de Guerrero,

<state>Guerrero</state>
, Mexico , 2. Laboratorio de Investigación en Inmunobiología y Diagnóstico Molecular, Universidad Autónoma de Guerrero, Guerrero, México., Universidad Autónoma de Guerrero, Laboratorio de Investigación en Inmunobiología y Diagnóstico Molecular, Universidad Autónoma de Guerrero,
<state>Guerrero</state>
, Mexico ,
3. Laboratorio de Investigación en Obesidad y Diabetes, Universidad Autónoma de Guerrero, Guerrero, México., Universidad Autónoma de Guerrero, Laboratorio de Investigación en Obesidad y Diabetes, Universidad Autónoma de Guerrero,
<state>Guerrero</state>
, Mexico ,
4. Laboratorio de Investigación en Parasitología, Universidad Autónoma de Guerrero, Guerrero, México., Universidad Autónoma de Guerrero, Laboratorio de Investigación en Parasitología, Universidad Autónoma de Guerrero,
<state>Guerrero</state>
, Mexico ,
5. Laboratorio de Investigación en Inmunotoxigenómica, Universidad Autónoma de Guerrero, Guerrero, México., Universidad Autónoma de Guerrero, Laboratorio de Investigación en Inmunotoxigenómica, Universidad Autónoma de Guerrero,
<state>Guerrero</state>
, Mexico

Correspondence: Autor de Correspondencia: Arturo Ramírez-Peralta. Laboratorio de Investigación en Patometabolismo Microbiano. Universidad Autónoma de Guerrero. Av. Lázaro Cárdenas s/n, Chilpancingo, Guerrero, México. Teléfono 7471896780. E-mail: E-mail:
Conflicto de Intereses* Los autores declaran no presentar conflictos de intereses.
* Contribución de los Autores: AGR: captación de pacientes y diagnóstico. VVA: apoyo técnico para Dol-Blot. PRI: redacción del manuscrito. RBE: análisis estadístico y redacción. MBS: análisis estadístico. RPA: propuesta del proyecto y apoyo experimental.


Resumen

El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de S. aureus, incluyendo resistentes a meticilina y la producción de enterotoxina A en fosas nasales de estudiantes universitarios en México. Este fue un estudio transversal realizado en 471 estudiantes universitarios de una ciudad del suroeste de México. Las muestras nasales y los datos sociodemográficos fueron obtenidos de los pacientes. Las cepas fueron identificadas como S. aureus basándose en la morfología, tinción de Gram, prueba de catalasa, prueba de coagulasa y fermentación en agar manitol salado. Las cepas se biotipificaron, se determinó la resistencia a meticilina por difusión en agar y la producción de enterotoxina A por Dot- Blot. La frecuencia de portadores nasales de S. aureus fue 10,40 %; 73,46 % resistentes a meticilina; 36,73 % producen enterotoxina A. En un análisis bivariado, se encontraron diferencias estadísticamente significativas en pacientes que viven cerca de aguas residuales y granjas con el estado de portador de S. aureus, (p=0,01, OR 2,59 [1,06-5,81]; p=0,01, OR 3,18, [1,07- 8,33]). Los portadores nasales muestran una diversidad de cepas de S. aureus, mayormente resistentes a meticilina, pero no todas producen enterotoxina A.

Recibido:Received: 2018 September 3; Aceptado:Accepted: 2019 January 21; Publicación en línea:: 2019 January 23

km. 2019 ; 47(1)

Copyright

©2019. Los Autores. Kasmera. Publicación del Departamento de Enfermedades Infecciosas y Tropicales de la Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la que permite el uso no comercial, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre y cuando la obra original sea debidamente citada.

Keywords: Palabras clave: Staphylococcus aureus, portador asintomático, SARM, enterotoxina.
Keywords: keywords: Staphylococcus aureus, asymptomatic carrier, MRSA, enterotoxin.

Introducción

Staphylococcus aureus es un patógeno humano invasivo con una elevada incidencia y morbilidad en la comunidad y en hospitales. Personas sanas y enfermas, presentan el riesgo de desarrollar diversas infecciones de la piel y tejidos blandos, endocarditis, osteomielitis, meningitis, bacteriemia y neumonía (incluida la neumonía desarrollada como complicación de la influenza) 1 con tasas de mortalidad que van de 5,60 a 40 % 2,3.

La cavidad nasal se ha considerado como un hábitat microbiano clínicamente importante, particularmente para S. aureus, el cual coloniza la zona anterior de las narinas 4. Varios estudios han demostrado que esta área es consistente para el aislamiento de este microorganismo; sin embargo, cuando las narinas son tratadas tópicamente para eliminarlos de la zona, en la mayoría de los casos, el microrganismo también desaparece de otras áreas del cuerpo 5,6.

En la población, aproximadamente el 20% de los individuos portan al menos una cepa de S. aureus en fosas nasales y son llamados portadores persistentes. En una gran proporción de la población (60%), se aísla S. aureus intermitentemente y la cepa cambia con frecuencia, a este tipo de portadores se les denomina portadores intermitentes. Por último, en una minoría de personas (20%) no se aísla S. aureus y son denominados no portadores 5.

El estado de portador se considera como un factor de riesgo importante para el desarrollo de infecciones invasivas por S. aureus4. Sin embargo, en los últimos años, el estudio de portadores ha considerado no solo el aislamiento del microorganismo, sino la búsqueda de factores de virulencia de impacto epidemiológico como la resistencia a meticilina y la producción de toxinas 7,8. La búsqueda de cepas de S. aureus enterotoxigénicas es un punto importante, debido a que las cepas presentes en las fosas nasales podrían ser transferidas a los alimentos por una mala manipulación y ocasionar una intoxicación alimentaria. Por lo tanto, en este estudio se determinó la frecuencia de portadores nasales de S. aureus, resistencia a meticilina y la producción de enterotoxina A.

Métodos

Tipo de estudio y población:

este es un estudio transversal que se llevó a cabo en 471 estudiantes universitarios en la región suroeste de México (Ciudad de Chilpancingo), seleccionados durante los meses de Enero a Junio de 2016. En el estudio, se incluyeron todos los estudiantes de 18 a 25 años de edad, excepto aquellos con enfermedades respiratorias agudas, que hubiesen consumido antibióticos durante siete días antes de la toma de muestra, con deformidades anatómicas de la nariz, con alguna condición física que no permitiera la colecta de la muestra o que no otorgaran el consentimiento informado. La investigación fue aprobada por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Autónoma de Guerrero.

Recolección de datos:

después de firmar el consentimiento informado, los datos sociodemográficos de los pacientes fueron colectados vía cuestionario. A los estudiantes se les preguntó acerca de la facultad a la que pertenecían, ingreso a hospitales y tratamiento antimicrobiano durante el último año, enfermedades crónicas respiratorias, infecciones en la piel o úlceras crónicas. Debido a que S. aureus coloniza mascotas y animales de granja 9, se les preguntó la convivencia con mascotas y si residían cerca de granjas y/o aguas negras; después de que los participantes llenaron el cuestionario, se les realizó la toma de muestra.

Toma de muestra y análisis microbiológico:

la muestra para el cultivo fue obtenida de la zona anterior de las fosas nasales de cada uno de los participantes con un hisopo de algodón humedecido previamente con solución salina estéril con ligeros movimientos circulares en tres ocasiones. El hisopado fue inmediatamente inoculado en agar manitol salado e incubado por 24 horas a 35ºC. Los aislados fueron identificados como S. aureus basados en pruebas convencionales morfológicas y bioquímicas, incluyendo: tinción de Gram, catalasa, coagulasa libre y fermentación de manitol.

Caracterización de biotipos de Staphylococcus aureus:

se ha descrito la biotipificacion de S. aureus para entender la diversidad de las cepas, lo cual se ha realizado a partir de perfiles bioquímicos que incluyen las pruebas de Voges- Proskaüer, reducción de nitratos; fermentación de trehalosa, sacarosa, lactosa y glucosa; descarboxilación de la lisina y ornitina 10 por lo cual, estas pruebas fueron utilizadas. Además, se incorporó la producción de ureasa, lipasa y beta hemólisis en sangre de carnero.

Determinación de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SARM):

SARM fue identificado mediante el ensayo de susceptibilidad a cefoxitina (discos de 30 µg) usando el método de difusión en agar y la interpretación de la prueba se realizó de acuerdo a los protocolos del Instituto de Estándares de Laboratorio Clínico 11.

Determinación de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus:

se realizó la determinación de la enterotoxina A a partir de cultivos bacterianos líquidos de 24 horas de las cepas estudiadas, incluida la cepa control S. aureus subsp. aureus (ATCC® 25923™). Para lo cual, se colocó 6 µl de sobrenadante en una membrana de nitrocelulosa (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EUA). La membrana se dejó secar y después fue bloqueada con leche deslactosada al 5% en TBS-T (Tris base, Cloruro de Sodio, Tween) durante una hora, seguido de tres lavados de 10 minutos con la misma solución de bloqueo. Después de los lavados, la membrana fue expuesta a un anticuerpo anti- seA dilución 1:5000 a 25ºC durante una hora. Después de tres lavados de cinco minutos con solución de bloqueo, la membrana fue incubada con un anticuerpo de tipo IgG conejo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EUA) dilución 1:5000. Después de tres lavados de cinco minutos con solución de bloqueo y uno con TBS-T, la membrana fue incubada con el sustrato TMB (3, 3’, 5, 5’ tetrametilbencidina) (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EUA) por un minuto. Los puntos teñidos fueron observados como puntos morados en la membrana, confirmando la producción de la enterotoxina A.

Análisis estadístico:

para la descripción de los datos se usaron medidas de distribución, tendencia central (mediana y rango intercuartílico). Las variables cualitativas se compararon utilizando el test de chi-cuadrado. El análisis del riesgo se realizó por análisis bivariado, calculándose razones de prevalencia y su intervalo de confianza del 95%. Para las variables cuantitativas, se determinó la distribución de los datos y se analizaron mediante el estadístico de prueba U de Mann-Whitney. El análisis estadístico se realizó con el programa STATA 12.00®.

Resultados

El estudio incluyó 471 estudiantes universitarios, de una edad promedio de 21 años, con distribución homogénea en cuanto al género (223 hombres, 248 mujeres); el 5,30% de los estudiantes muestreados refirió asma; 8,49% presentó una herida en zonas anatómicas distintas a fosas nasales; 28,23% fumaba; 49,92% usó antibióticos durante el último año y 11% estuvo hospitalizado dentro de este mismo lapso de tiempo; 10,40% refirió vivir cerca de aguas negras; 5,94% de granjas y 37,50% convivía con niños. Del total de la población estudiada, se aislaron 49 cepas de S. aureus (10,40%), con mayor frecuencia en alumnos que residían cerca de aguas negras (20,83%) y en los que habían estado hospitalizados en el último año (19,23%). Al determinar la resistencia a meticilina, se encontró que el 73,46% (36/49) de las cepas fueron S. aureus resistentes a meticilina (SARM), los cuales fueron más frecuentes también en estudiantes que residían cerca de aguas negras (18,75%) y en aquellos que se lavaban las manos con una frecuencia promedio de 4 ocasiones en el transcurso del día (Tabla 1). Se determinó la producción de enterotoxina A en las cepas aisladas, encontrándose una frecuencia del 36,73% (18/49) (Figura 1). Las cepas de S. aureus productoras de enterotoxina A (S. aureus seA+), se aislaron con mayor frecuencia en pacientes que habían estado hospitalizados durante el último año previo a la obtención de la muestra. En cuanto a las Facultades a las cuales pertenecían los estudiantes, las frecuencias para los portadores de S. aureus van del 5,55% al 11,81%, en estudiantes de la Facultad de Economía y Filosofía y Letras. No se encontraron portadores nasales asintomáticos para este microorganismo, sin encontrarse una diferencia significativa entre las frecuencias. La captación de estudiantes fue mayor en la Facultad de Ciencias Químicas, debido a la ubicación del laboratorio de Investigación.

Tabla 1.

Características sociodemográficas de la población universitaria portadora de S. aureus, SARM y S. aureus enterotoxigénico


Características sociodemográficas Población total N=471 S. aureus N= 49 SARM N= 36 S. aureus (seA+) b
Edad a 21 (20-22) 21 (20-22) 21 (20-22) 20 (20-21)
Género n (%)
Hombres 223 (47,34) 29/ 13,18 19/ 8,52 9/ 4,03
Mujeres 248 (52,66) 20 / 8,06 17/ 6,85 9/ 3,62
Facultad
Ciencias Químicas 347 (73,67) 41 (11,81) 31 (8,93) 16 (4,61)
Ingeniería 84 (17,83) 7 (8,33) 4 (4,76) 1 (1,19)
Derecho 18 (3,82) 1 (5,55) 1 (5,55) 1 (5,55)
Economía 19 (4,03) 0 0 0
Filosofía y Letras 3 (0,63) 0 0 0
Asma n (%) 25 (5,30) 4 /16,00 1/ 4,00 2/ 8,00
Presencia de heridas n (%) 40 (8,49) 7/ 17,50 3/ 7,50 2/ 5,00
Hábito tabáquico n (%) 133 (28,23) 12/ 9,02 10/ 7,51 5/ 3,75
Uso de antibióticos c n (%) 221 (46,92) 26/ 11,76 20/ 9,04 10/ 4,52
Hospitalización c n (%) 52 (11,04) 10/ 19,23* 7/ 13,46 5/ 9,61*
Cercanía d n (%)
Aguas negras 48 (10,19) 10/ 20,83* 9/ 18,75* 3/ 6,25
Granjas 28 (5,94) 7/ 25,00* 4/ 14,28 2/ 7,14
Convivencia con niños n (%) 177 (37,57) 15/ 8,47 8/ 4,51 9/ 5,08
Frecuencia de lavado de manos a,e 2(2-4) 3(2-5) 4(2-5)** 3(2-5)

TFN1(a) Datos reportados con mediana (p25-p75). Los datos restantes son presentados en frecuencias absolutas y relativas. (b) Determinado por dot-blot. (c) durante el último año. (d) ubicación de la vivienda con respecto a aguas negras y granjas. (e) durante el día. (*) Estadísticamente significativos, calculados por Xi cuadrado. (**) Estadísticamente significativos, calculados por U de Mann-Whitney. SARM) Staphylococcus aureus resistentes a meticilina.



[Figure ID: f1] Figura 1.

Producción de enterotoxina A en S. aureus aislados de portadores asintomáticos entre estudiantes universitarios. Línea 1-4. Sobrenadantes de cepas de S. aureus aisladas de portadores asintomáticos entre estudiantes universitarios. Línea 5. Control positivo. Línea 6. Control negativo


Con los datos obtenidos, se determinó que los pacientes que residían cerca de aguas negras y granjas tenían 2,59 (1,06- 5,81, p= 0,01) y 3,18 (1,07- 8,33, p= 0,01) veces más riesgo de portar S. aureus respectivamente; y en el caso del primer grupo, también tenían 3,38 (1,30- 8,06, p=0,02) veces más riesgo de ser portadores de SARM (Tabla 2).

Tabla 2.

Factores de riesgo asociados con el estado portador de S. aureus, SARM y S. aureus enterotoxigénico


Factor de riesgo S. aureus SARM S. aureus (seA+) d
n OR (IC 95%) p n OR (IC 95%) p n OR (IC 95%) p
Hospitalizacióna
Si 10 2,31 (0,95-5,16) 0,03 7 2,09(0,72- 5,24) 0,09 5 3,32 (0,88- 10,97) 0,02
Nob 42 1 45 1 47 1
Cercanía
Aguas negras
Si 10 2,59 (1,06- 5,81) 0,01* 9 3,38 (1,30-8,06) 0,02* 3 1,81 (1,32- 6,75) 0,35
Nob 38 1 39 1 45 1
Granjas
Si 7 3,18 (1,07- 8,33) 0,01* 4 2,14(0,50- 6,77) 0,17 2 2,05 (0,21- 9,49) 0,34
Nob 21 1 24 1 26 1
Convivencia con niños
Si 15 0,70 (0,34-1,38) 0,28 8 0,44 (0,17-1,04) 0,05* 9 1,69 (0,58- 4,92) 0,26
Nob 162 1 169 1 168 1

TFN2(a) durante el último año. (b) Consideradas como parámetros de referencia, por lo tanto, para el cálculo de OR. están asignados con la unidad. (c) ubicación de la vivienda con respecto a aguas negras y granjas. (d) determinado por dot-blot. (*) Estadísticamente significativos, modelo de regresión logística bivariado. SARM) Staphylococcus aureus resistentes a meticilina.


Al realizar la caracterización en biotipos de las 49 cepas aisladas, se encontró una amplia variabilidad de cepas al determinarse 24 biotipos, siendo los más frecuentes el 6, 10 y el 13, agrupándose 5 cepas en el primero y 6 en los otros dos (Tabla 3).

Tabla 3.

Perfiles bioquímicos de S. aureus en portadores asintomáticos


Biotipo n N= 49 Ure Cit Glu Orn Nit Sac Lac Ac Tre RM n (%) seA n (%)
1 1 - - + - + - - + + 1 (100) 0 (0)
2 1 - - + + - + - + - 0 (0) 0 (0)
3 1 - - + - + + - + - 1 (100) 1 (100)
4 4 - - + - + + - - + 1 (25) 4 (25)
5 1 - - + + + + - + - 1 (100) 0 (0)
6 5 - - + + + + + + + 3 (60) 3 (60)
7 2 + - + + + + - + + 2 (100) 0 (0)
8 1 - + + + + - + + + 1 (100) 0 (0)
9 3 - - + + + - - + + 3 (100) 1 (33.3)
10 6 - - + - + + - + + 6 (100) 0 (0)
11 4 - - + - + + + + + 2 (50) 3 (75)
12 1 - - + + + + + - + 1 (100) 1 (100)
13 6 - - + + + + - + + 3 (50) 2 (33.3)
14 2 + - + - + + - + + 2 (100) 0 (0)
15 4 + + + + + + + + + 2 (50) 1 (25)
16 1 + + + + + - + + - 1 (100) 0 (0)
17 1 + + + + + - + + + 1 (100) 0 (0)
18 1 + + + + - + + - + 1 (100) 0 (0)
19 1 + - + + - + - + - 1 (100) 1 (100)
20 1 + - + + + - - + + 1 (100) 0 (0)
21 1 - - + + + - - - + 1 (100) 1 (100)
22 1 + - + - + + - - + 1 (100) 0 (0)
23 1 + - + + + + - - + 1 (100) 0 (0)
24 1 + - + - + + + - + 1 (100) 0 (0)

TFN3Ure= urea. Cit= citrato. Glu= glucosa. Orn= ornitina. Nit= nitrato. Sac= sacarosa. Lac= lactosa. Ace= producción de acetoína. Tre= trehalosa. +) positivos. -) negativos. RM) resistencia a meticilina. SeA) Producción de enterotoxina A.


Al comparar la resistencia a meticilina, se encontró que, en la mayoría de los biotipos (95,83%), se encontraban cepas con esta característica; no comportándose de la misma forma la producción de enterotoxina A, la cual se presentó con diferentes frecuencias, solo en 10 biotipos distintos (41,66%).

Discusión

El estado de portador de S. aureus en fosas nasales ha sido reconocido como un factor de riesgo para el desarrollo de infecciones 4. Es importante comprender las dinámicas de la colonización nasal y la virulencia para diseñar estrategias que reduzcan las tasas de infección y diseminación. En el presente estudio, la presencia de S. aureus en fosas nasales fue de 10,40%. También, se determinó la frecuencia de SARM, la cual fue de 73,46% del total de los aislados. En este estudio, se detectaron no solamente los portadores nasales de S. aureus, sino también una característica importante como es la producción de enterotoxina A, encontrándose una frecuencia del 36,73% del total de las cepas aisladas.

Diversos estudios han realizado la búsqueda de S. aureus en fosas nasales en trabajadores en el área de la salud, reportando frecuencias de 11,04%; 15,00% y 20,58% en Nepal, Madagascar y Brasil respectivamente 12,13,14; también se han descrito estudios en niños donde las prevalencias son de 48,00%; 21,81% y 18,10% en Brasil, EUA y China respectivamente 15-17. Sin embargo, es importante considerar en la población, personas que no sean estudiantes o trabajadores directamente relacionados al área de la salud, lo que permitiría obtener información en relación a otros factores de riesgo no relacionados al cuidado de la salud que podrían ser significativos. Además de aportar los datos en relación a la frecuencia de este patógeno en dicha población. Dentro de estos factores, se encuentra el residir cerca de granjas. En este sentido, diversos estudios han evidenciado la presencia de SARM en casos de mastitis bovina 18 y, de manera general, en granjas lecheras de bovinos, ovinos y caprinos 19, además, de demostrar la presencia de este microorganismo en el aire circulante en granjas 20, confirmando en este estudio, que el ambiente en granjas o vivir próximos a estos lugares, podría favorecer el estado de portador de S. aureus. No solamente la residencia cercana a granjas fue importante; sino también la cercanía de la misma a aguas negras. En este aspecto, se ha determinado la presencia de S. aureus en una planta tratadora de aguas residuales relacionándola a la llegada de aguas residuales de un hospital de la ciudad como mecanismo de transmisión 21; considerando un aporte relevante de este estudio; sin embargo, esta investigación no tuvo capacidad de demostrar el mecanismo de transmisión; pero se supone que los mecanismos de diseminación podrían ser similares al reportado.

Se ha realizado la búsqueda de S. aureus enterotoxigénico en una amplia variedad de alimentos como helado 22, queso 23, y leche 24; sin embargo, es poca la información en portadores asintomáticos, siendo el gen de la enterotoxina A el más frecuentemente encontrado en estos estudios 25,26, la cual fue determinada, particularmente, en la presente investigación, evidenciándose que el 36,73% de los portadores asintomáticos están colonizados por una cepa enterotoxigénica, aportando información reciente acerca de la circulación de estas cepas en portadores en la población universitaria, la cual frecuentemente se desempeña como manipuladora de alimentos y pueden transmitir estas cepas a alimentos y ocasionar brotes de intoxicación alimentaria por S. aureus. Por otro lado, se ha descrito la actividad superantigénica de esta enterotoxina, e incluso, se ha intentado relacionar con diversas enfermedades autoinmunes como esclerosis múltiple 27, dermatitis atópica 28, asma 29; lo cual remarca la importancia de la determinación de esta enterotoxina en las cepas aisladas.

Por último, la biotipificación permitió observar una gran diversidad de cepas de S. aureus circulando en portadores asintomáticos universitarios y no solo a nivel bioquímico, sino también en cuanto a características de virulencia, donde en la mayoría de biotipos se encontraron cepas de SARM; sin embargo, no en todos los biotipos se encontró la presencia de la enterotoxina A. Esta enterotoxina se transfiere a partir de elementos genéticos móviles 30 al igual que la resistencia a meticilina, por ende, encontrar esta diversidad, permite vislumbrar la capacidad de estas cepas para adquirir material genético y generar cepas con un alto potencial virulento. Cabe mencionar que no solo las características de virulencia se transfieren a partir de elementos genéticos móviles, sino también características metabólicas; por ejemplo, la utilización de la arginina, incluso esta se ha relacionado con la resistencia a meticilina, infiriendo que ambas características son transferidas de la misma manera 31, por lo que los perfiles bioquímicos y de virulencia de estas cepas, describen la diversidad genética de S. aureus en un grupo particular de importancia clínica y alimentaria.


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