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Medio de cultivo convencional enriquecido con extractos de quinoa, amaranto y chía promueve el crecimiento de Staphylococcus aureus.

Conventional culture media enriched with extracts of quinoa, amaranth and chia promotes the Staphylococcus aureus growth.

Elizabeth Proaño-Pérez1, Israel Manjarres-Raza2,

Cristian Carvajal-Tapia2 y Wilber Romero-Fernandez1

1Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Técnica de Ambato, Ecuador.

2Facultad de Ciencias e Ingeniería en Alimentos.Universidad Técnica de Ambato, Ecuador.

Autor corresponsal: Dr. Wilber Romero Fernández, PhD,

e-mail: wromfdez@uta.edu.ec

RESUMEN

La identificación bacteriana durante las infecciones microbiológicas es un aspecto crítico a la hora de escoger un tratamiento específico para evitar complicaciones del paciente o en algunos casos su muerte. Por ello, incrementar el crecimiento celular durante el diagnóstico clínico por cultivo bacteriano puede reducir el tiempo para determinar el patógeno que causa la enfermedad. En este trabajo, se utilizó el cultivo bacteriano como metodología y se evaluó el crecimiento de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo convencional enriquecido con extractos de Chenopodium quinoa, Amaranthus caudatus y Salvia hispanica. Los resultados obtenidos muestran que estos extractos, a bajas concentraciones, tienen un efecto protector contra la citotoxicidad que se podría generar por el estrés oxidativo producto del metabolismo celular de las bacterias cultivadas in vitro e incrementan significativamente el crecimiento bacteriano. La adicción de estos extractos a los medios convencionales podría mejorar el crecimiento bacteriano durante un diagnóstico bacteriológico y reducir el tiempo de identificación del patógeno.

Palabras clave: Chenopodium quinoa, Amaranthus, Salvia hispanica, Staphylococcus aureus, crecimiento bacteriano.

ABSTRACT

Increasing the bacterial growth rate reduces the time getting the bacteria identification. This is helpful to choose an accurate and quick therapeutic strategy during microbiological infections, avoiding illness complications or in some cases the death. Here, we used bacterial growth method and we evaluated the growth of Staphylococcus aureus including an extract of Chenopodium quinoa, Amaranthus caudatus and Salvia hispanica in the routine culture media. Results show that adding these extracts, at low concentrations, have a protective effect against the cytotoxicity that could be generated by the oxidative stress product of the cellular metabolism of the bacteria growing in vitro and significantly increase the bacterial growth. The addition of these extracts to conventional culture media could improve bacterial growth during a bacteriological diagnosis and to reduce the time of pathogen identification.

Key words: Chenopodium quinoa, Amaranthus caudatus, Salvia hispanica, Staphylococcus aureus, bacterial growth.

INTRODUCCIÓN

Las infecciones microbiológicas continúan siendo un problema de salud tanto a nivel de la comunidad como en los centros sanitarios. Escoger un rápido y certero tratamiento para las infecciones causadas por bacterias evita complicaciones de los pacientes y en ocasiones su muerte (1).

A pesar que en la actualidad las técnicas de biología molecular son importantes herramientas de diagnóstico microbiológico (2-4), los cultivos bacteriológicos siguen siendo utilizados para la identificación de los patógenos que causan infecciones (5). Por ello, nuevas aportaciones que mejoren esta forma de diagnóstico resulta relevante en el diagnóstico clínico.

Chenopodium quinoa (quinoa), Amaranthus caudatus (amaranto) y Salvia hispanica (chía) son altamente apreciadas por su valor nutricional (6). Estos productos naturales son ricos en proteínas, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y ácidos grasos poliinsaturados (7-11).

Evidencias experimentales muestran que el extracto de quinoa presenta propiedades antioxidantes, inmunoreguladoras y antiinflamatorias (12-14). En este sentido, ácidos grasos, tocoferoles, tocotrienoles y carotenoides presentes en la quinoa blanca, roja y negra, han sido asociados con la actividad antioxidante (14). Sin embargo, las propiedades inmunoreguladoras y antiinflamatorias parecen estar relacionadas con una fracción de polisacáridos (12,13). También, se ha informado la presencia de compuestos fitoecdisteroides en las semillas de quinoa con capacidad de regular la diabetes (15). Resulta novedoso que un estudio reciente muestra que el extracto de quinoa es un sustrato idóneo para el crecimiento de Lactobacillus plantarum (16). Una mezcla de quinoa y amaranto aporta gran cantidad de glicanos, algunos de los cuales son importantes fuentes de energía para el crecimiento bacteriano (17). También, se ha descrito que el extracto de amaranto tiene capacidad protectora contra compuestos tóxicos (18) y que la chía puede restaurar el sistema antioxidante en animales de experimentación (19).

Hasta la fecha, la mayoría de estudios que involucran la quinoa, el amaranto y la chía están enfocados en su capacidad nutricional. No obstante, se ha demostrado que una biopelícula obtenida de quinoa presentó actividad antibacteriana frente a Escherichia coli (E. coli) y Staphylococcus aureus (S. aureus) (20). También, polifenoles aislados de la quinoa se emplean para el tratamiento del cáncer (21). A pesar de ello, los estudios respecto a las aplicaciones biomédicas de estos compuestos resultan escasos.

Con el objetivo de incrementar el crecimiento bacteriano durante un diagnóstico clínico y reducir el tiempo de identificación del patógeno, en este trabajo, se evaluó el crecimiento de una bacteria relevante en la práctica clínica en un medio de cultivo convencional enriquecido con extractos de quinoa, amaranto y chía.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepa bacteriana y condiciones de cultivo

Una colonia de S. aureus (ATCC12435) crecida por 24 horas en medio Luria-Bertani (LB) sólido fue resuspendida en medio LB líquido a 37 °C (pH 7,0 y 10 g/L de NaCl) en una atmósfera húmeda con tensión de oxígeno normal. Las células fueron cultivadas por ٤ horas antes de realizar los experimentos. 

Enriquecimiento del cultivo celular

El medio de cultivo LB fue suplementado con cada uno de los extractos (quinoa, amaranto y chía) o con una combinación de los mismos (quinoa-chía, quinoa-amaranto, amaranto-chía), utilizando dos concentraciones de cada uno de ellos (0,1 mg/ml y 0,5 mg/ml). Los medios de cultivos enriquecidos fueron inmediatamente utilizados.

Determinación del crecimiento bacteriano

Medio de cultivo LB fresco (control) y medio LB enriquecidos fueron inoculados con 1x106 células de S. aureus. Los cultivos fueron incubados a 37 °C en agitación en una atmósfera húmeda con tensión de oxígeno normal. El crecimiento bacteriano fue monitorizado por la medición de la densidad óptica a 600 nm cada 2 horas, por un total de 12 horas utilizando un Nanodrop (Bio-Rad, USA) en el medio de cultivo LB fresco (control) y medio LB enriquecido, con y sin el agregado de peróxido de hidrógeno (H2O2) a 0,00015% (v/v) como agente oxidante para inducir las especies reactivas del oxígeno.

Análisis y presentación de los resultados

El número de muestras (n) en cada condición experimental se indica en los pies de las figuras. Para el análisis estadístico se realizó un análisis bidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de un post-test de Bonferroni. El valor de P ≤ 0,05 fue considerado significativo. Para graficar los datos se utilizó el software GraphPad Prism 5.

RESULTADOS

Se evaluó el crecimiento de S. aureus en un medio de cultivo convencional enriquecido con extractos con de quinoa, amaranto y chía. Los resultados obtenidos muestran que la adición de los extractos al medio de cultivo convencional incrementa significativamente el crecimiento de la bacteria (Figura 1). Hay que señalar que, aunque se utilizaron dos concentraciones diferentes de cada uno de los extractos (0,1 y 0,5 mg/ml) solo la concentración de 0,5 mg/ml mostró resultados significativos. También se emplearon los extractos de forma individual y en diferentes combinaciones (quinoa-chía, quinoa-amaranto, amaranto-chía) y los resultados indican que hay un ligero incremento del crecimiento bacteriano en estas muestras, pero no es significativamente diferente respecto al crecimiento obtenido en el medio convencional (datos no mostrados).

Dado que la adición de los tres extractos mejora el crecimiento bacteriano respecto al control y en la literatura se informa que, de forma independiente estos compuestos, se caracterizan por presentar propiedades antioxidantes, se exploró si los extractos logran mejorar el crecimiento bacteriano en un cultivo sometido a estrés oxidativo.

Los resultados muestran un mayor crecimiento en el medio suplementado con los extractos respecto al medio de cultivo convencional, lo que sugiere que el medio enriquecido puede reducir el estrés oxidativo inducido por (H2O2) (Figura 2).

Fig 1. Medio de Luria-Bertani suplementado incrementa el crecimiento bacteriano. La figura muestra el crecimiento de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo enriquecido con los extractos de quinoa, amaranto y chía. Los datos que se muestran son representativos de los resultados obtenidos y se presentan en forma de crecimiento del microorganismo como absorbancia a 600 nm en el tiempo (media ± error estándar de la media, n=3, en triplicado). El análisis estadístico se realizó a través de un análisis bidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de un post-test de Bonferroni. El valor de P < 0,05: *Significativamente diferente comparado con el control a las 10 horas. El valor de P < 0,01: **Significativamente diferente comparado con el control a las 12 horas. Para la presentación gráfica de los resultados se utilizó el programa GraphPad Prism 5.

Fig 2. Los extractos de quinoa, amaranto y chía protegen a las células de S. aureus en cultivo del estrés oxidativo. La figura muestra el crecimiento de Staphylococcus aureus en un medio de cultivo enriquecido con los extractos de quinoa, amaranto y chía sometido a un agente oxidante. Los datos que se muestran son representativos de los resultados obtenidos y se presentan en forma de crecimiento del microorganismo como absorbancia a 600 nm en el tiempo (media ± error estándar de la media, n=3, en triplicado). El análisis estadístico se realizó a través de un análisis bidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de un post-test de Bonferroni. El valor de P < 0,05: *Significativamente diferente comparado con el control a las 12 horas. Para la presentación gráfica de los resultados se utilizó el programa GraphPad Prism 5.

DISCUSIÓN

Durante las infecciones microbiológicas reducir el tiempo para identificar el patógeno y conocer su perfil de resistencia a los antibióticos es un aspecto clave a la hora de elegir una rápida y específica estrategia terapéutica que permite una pronta recuperación del paciente y garantiza su supervivencia (1,22). A pesar de los avances en el diagnóstico y la asistencia sanitaria, la mortalidad relacionada con la sepsis sigue siendo considerable, y representa la segunda causa de muerte en unidades de cuidado intensivo no coronaria (23). En este sentido, el tratamiento antimicrobiano inapropiado es una preocupación a nivel mundial que se asocia a factores críticos como el aumento de la mortalidad por sepsis (24,25) o la resistencia microbiana a los antibióticos (26,27).

En la actualidad, los cultivos bacteriológicos se continúan empleando para el diagnóstico y la identificación de patógenos. Para muchos el cultivo de sangre todavía representa un buen método de aislamiento de patógenos presentes en el torrente sanguíneo (28,29). Teniendo en cuenta que S. aureus continúa siendo uno de los microorganismos más aislados en las infecciones bacterianas (30) y que incrementar su crecimiento in vitro durante el diagnóstico microbiológico puede repercutir de forma positiva en la salud del paciente, en este trabajo se evaluó el crecimiento de S. aureus en un medio de cultivo convencional enriquecido con extractos de quinoa, amaranto y chía.

Se ha observado que la adición de los extractos al medio de cultivo convencional incrementa significativamente el crecimiento de S. aureus. Sin embargo, resulta contradictorio que estos extractos pueden presentar actividad antimicrobiana sobre algunas especies. Un estudio previo mostró que un extracto de quinoa a altas concentraciones tuvo efecto antibacteriano contra E. coli y S. aureus (31). También, resulta interesante que la administración de resolvina D2, un autacoide de estructura lipídica que puede derivar del metabolismo de los ácidos grasos omega-٣, mejora la supervivencia en un modelo de sepsis multibacteriana (32), y que la alimentación de ratones con una dieta rica en ácidos grasos poliinsaturados mejora la supervivencia durante una sepsis inducida por S. aureus (33). Al parecer estas propiedades antimicrobianas están más relacionadas con la modulación de la respuesta inmune que la acción directa sobre las bacterias. A pesar de ello, los resultados obtenidos en la presente investigación muestran que si los extractos se mantienen a una concentración por debajo de 1 mg/ml mejoran el crecimiento bacteriano y carecen de propiedades antibacterianas.

También, se ha descrito que a partir de las semillas de amaranto se puede aislar péptidos con actividad antimicrobiana y que estos pueden ser fuertemente antagonizados por cationes (34). Para evitar la aparición de posible capacidad antimicrobiana del extracto de amaranto, se utilizó el medio LB con altas concentraciones del catión monovalente sodio.

Por otra parte, se ha reportado que compuestos fenólicos obtenidos de quinoa tiene un efecto inhibitorio en la proliferación de células de cáncer de próstata y que sus propiedades anticancerígenas se deben a la reducción del estrés oxidativo (21). Adicionalmente, se ha demostrado que la chía restaura el sistema antioxidante en animales de laboratorio (19) y que el amaranto tiene un efecto quimioprotector contra metabolitos tóxicos (18). Dado estos hallazgos, se decidió explorar un posible mecanismo por el cual estos extractos podrían mejorar la viabilidad celular.

El (H2O2) es un agente oxidante que ha demostrado tener un amplio espectro de citotoxidad contra virus, bacterias, levaduras y esporas (35,36). A pesar de la producción de catalasa por S. aureus se utilizó bajas concentraciones de H2O2 para inducir estrés oxidativo. Los resultados muestran un número de bacterias significativamente superior en el medio de cultivo enriquecido con los extractos con respecto al medio de cultivo convencional, lo que hace pensar que el suplemento puede reducir el estrés oxidativo inducido por H2O2.

Se ha planteado que estos extractos y en especial la quinoa presentan una serie de compuestos con propiedades antioxidantes como los polifenoles y tioles, y que esta fracción podría ser la responsable de inhibir tanto la peroxidación lipídica como la pérdida de grupos tioles (37). La presencia de grupos tioles libres podría justificar la protección de las bacterias al estrés oxidativo generado por H2O2, estos compuestos pueden proteger los residuos de cisteínas en las proteínas a través su reducción directa (38) o por la formación de disulfuros mixtos que son sustratos de las enzimas que catalizan su regeneración, como tiorredoxina (39). Esto sustentaría la idea de que la mezcla de estos extractos puede actuar como un agente reductor de grupos disulfuro.

A todo ello podemos sumar que a pesar que los mecanismos de la acción antioxidante de los polisacáridos aún son polémicos, varios estudios han postulado que estas macromoléculas, en parte, pueden ser agentes reductores y participar en la eliminación de los radicales libres (40). Por lo que, el contenido de polisacáridos o glicoconjugados presentes en estos extractos podrían explicar en parte la actividad antioxidante presente en esta compleja mezcla.

Los hallazgos obtenidos sugieren que la mezcla de los extractos quinoa, amaranto y chía utilizados, a bajas concentraciones, tienen un efecto protector contra especies reactivas del oxígeno generadas por el metabolismo celular de las bacterias cultivadas in vitro, lo que favorece el crecimiento bacteriano de S. aureus.

Esfuerzos adicionales se deben realizar para estandarizar el uso de estos extractos en la preparación de medios de cultivo para diagnóstico bacteriológico y evaluar el crecimiento de otras bacterias de interés clínico.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por la Universidad Técnica de Ambato (Resolución 0932-CU-P-2016) y el Programa “Becas Prometeo” de la Secretaria de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación del Gobierno de Ecuador para Wilber Romero Fernández.

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