Explorando el papel funcional de POU5F1 utilizando la electroporación CRISPR RNP de cigoto (CRISPR-EZ) en búfalos

• Meeti Punetha Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• Dharmendra Kumar Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• Suman Choudhary Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• Sheetal Saini Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• Kamlesh Kumari Bajwa Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• Surabhi Sharma Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• Manu Mangal Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• P. S. Yadav Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India
• T. K. Datta Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana, India

DOI: https://doi.org/10.52973/rcfcv-wbc132

Palabras clave: RNP, electroporación, cigotos, búfalo, POU5F1

Resumen

POU5F1, un factor de transcripción clave, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la pluripotencia y la diferenciación celular, lo que lo hace de inmenso interés en la biología del desarrollo y la cría de animales. En el presente estudio, empleamos la metodología de electroporación de cigotos (CRISPR-EZ) de ribonucleoproteína CRISPR (RNP) de última generación para manipular con precisión el gen POU5F1 en cigotos de búfalo para explorar los resultados fenotípicos y funcionales del desarrollo embrionario. A través de una combinación de estrategias, encontramos que la electroporación del cigoto de búfalo a 20 V/mm, 5 pulsos, 3 ms a las 10 h post-inseminación (hpi) resultó en una mayor permeabilidad de la membrana y una mayor eficiencia de edición (88,71%) sin afectar el potencial de desarrollo embrionario. Nos dirigimos al gen POU5F1 de búfalo utilizando los parámetros mencionados anteriormente, lo que provocó una descomposición del ARNm
mediada sin sentido y condujo a una desactivación completa (KO) del gen POU5F1. Analizamos las tasas de mutación y las mutaciones en mosaico utilizando el software de seguimiento de Indels por descomposición (TIDE). No observamos diferencias en la competencia de desarrollo embrionario en la tasa de escisión o blastocisto entre los embriones del grupo control, POU5F1-KO y los de control electroporados. Determinamos la expresión de SOX2, Nanog y GATA2 en POU5F1 intacto (Control) y en blastocisto confirmado con POU5F1-KO para comprender mejor el impacto de POU5F1-KO en otros genes pluripotentes. En embriones en etapa de blastocisto, POU5F1-KO alteró significativamente (p<0,05) la expresión de SOX2, Nanog y GATA2. En conclusión, la electroporación directa del componente CRISPR RNP en la etapa anterior del cigoto fue eficaz para crear mutaciones en el gen POU5F1. Desarrollamos un protocolo sencillo y directo para la edición de genes, que podría servir como un método valioso para estudiar la genómica funcional de los embriones de búfalo.