Establecimiento exitoso de poblaciones de células clonales editadas con genoma basado en CRISPR a partir de células primarias de búfalo, cabra y oveja
Resumen
La tecnología de edición del genoma tiene un gran potencial para la modificación precisa del ADN en células de mamíferos. La capacidad de generar con precisión la población clonal del genotipo editado con CRISPR es de gran importancia en el análisis de la función/vía genética, el descubrimiento de fármacos y la producción de animales con genoma editados. En el presente estudio, demostramos un método eficiente para generar poblaciones clonales unicelulares de animales de granja editadas con CRISPR, incluidos búfalos, cabras y ovejas. Para generar poblaciones de células clonales, los fibroblastos primarios se establecieron mediante cultivo de explante y luego se sometieron a electroporación con CRISPR/Cas RNP dirigidas al gen MSTN alterado. Utilizamos un método de recogida de una sola célula en el que se recogió una célula utilizando un capilar de vidrio ultrafino y se transfirió a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Para promover el crecimiento de células individuales, utilizamos medios suplementados con factor de crecimiento. Después de sembrar una única célula en cada pocillo, la placa se mantuvo en reposo durante 5 a 7 días y luego se anotaron las tasas de unión de las células. Informamos que las tasas de unión celular para las células de búfalo, cabra y oveja fueron del 40%, 77,08% y 83,67%, respectivamente. Las ta-sas de proliferación fueron del 70,83%, 75,67% y 78,05% para las células de búfalo, cabra y oveja, respectivamente. Notamos que las tasas de proliferación y unión celular eran mejores en el caso de las células de cabra y oveja; además, estas células exhibieron menos vacuolización en comparación con las células de búfalo. En el presente estudio, generamos 11, 20 y 20 clones unicelulares de células de búfalo, cabra y oveja editadas con el gen MSTN (miostatina). En conclusión, nuestro método se puede utilizar de manera eficiente para generar clones unicelulares con genoma editados para aprovechar el potencial de las tecnologías CRISPR en animales de granja.
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