Producción de embriones en etapa de blastocisto con desactivación del gen β-lactoglobulina (BLG) de búfalo de agua indio utilizando tecnología CRISPR y SCNT
Resumen
En varios países tropicales, la leche de búfala tiene una demanda de mayor valor que la leche de vaca debido a su valor nutricional y económico. En la India, la búfala es el principal animal lechero y aporta el 45% del total de leche producida en el país. Además del valor nutricional de la leche, se han informado varias proteínas alergénicas como la caseína, la α-lactoalbúmina, la β-lactoglobulina (BLG) y las inmunoglobulinas. Las estrategias de reproducción, el manejo nutricional y la genética cuantitativa han mejorado la producción de leche, pero estos enfoques no han podido conducir a cambios significativos en la composición de la leche. Con el desarrollo de la biotecnología, especialmente las herramientas de edición del genoma (CRISPR), es posible generar nuevos productos con valor agregado, como el diseño de leche hipoalergénica para beneficiar la salud humana. Teniendo esto en cuenta, planeamos utilizar las herramientas CRISPR para alterar el gen de la β- lactoglobulina de búfala (BLG) y así producir leche hipoalergénica a largo plazo. Para lograr nuestros objetivos, diseñamos tres guías de ARN de guía única (sgRNA) dirigidos al locus BLG en búfalos. Posteriormente, evaluamos su eficiencia de edición mediante una combinación de secuenciación Sanger, seguida de análisis TIDE e ICE. Entre los tres sgRNA, se utilizó el sgRNA más eficiente para generar la población clonal de células editadas. Se establecieron y seleccionaron varios clones unicelulares utilizando los métodos de clonación TA (también conocida como clonación rápida o clonación T) y secuenciación de Sanger. De los 14 clones unicelulares analizados, se encontró que ocho tenían eventos de alteración del gen BLG (tasas de edición del 57%). Utilizando transferencia nuclear de células somáticas (SCNT), producimos con éxito embriones clonados en etapa de blastocisto a partir de 4 células clonales alteradas por el gen BLG. Las tasas de producción de blastocistos clonados (25 a 30%) fueron similares a las de las células de control no editadas. Se están realizando esfuerzos para establecer preñeces a partir de embriones clonados BLG-KO. Este trabajo puede conducir a la generación de búfalos diseñados para producir leche hipoalergénica para beneficio humano.
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