Artículo Original
Bacteriología
Kasmera 47(1):38-43,
Enero-Junio, 2019. ISSN 00755222 E-ISSN
2477-9628
Ávila-Roo
Yeiny. (Autor de Correspondencia). Laboratorio
de Bacteriología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad del
Zulia. Calle 65 con Av. 19. Edificio Ciencia y Salud, Maracaibo. Venezuela.
Teléfono: +058-4246812465. E-mail: yavila@fmed.luz.edu.ve
Ginestre-Pérez
Messaria. Cátedra Bacteriología
General. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela.
E-mail: messaria@hotmail.com
Castellanos-Tolosa
María. Escuela de Bioanálisis.
Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: mariandre2910@gmail.com
Escobar-Velásquez
Franci. Escuela de Bioanálisis.
Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: escobar.franci@gmail.com
Briceño-Peñaloza
Amarilis. Escuela de Bioanálisis.
Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: amarilis_danger@hotmail.com
Valero-Leal
Kutchynskaya. Cátedra Bacteriología
Clínica. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela.
E-mail: kutchynskaya@gmail.com
Rincón-Villalobos
Gresleida. Cátedra Bacteriología
Clínica. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela. E-mail: gresle61@hotmail.com
Rivera-Salazar
Jhoandry. Laboratorio de Biología
Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo. Venezuela.
E-mail: jhoandriveras@gmail.com
Resumen
La formación de biopelícula es una estrategia
de vida para la mayoría de las bacterias, ya que aumenta las posibilidades de
transferencia de material genético y la resistencia a antibióticos, participa
en la comunicación celular y ofrece protección en condiciones adversas y
variables del medio ambiente; lo que contribuye a una colonización exitosa del
hospedador. Esta investigación se propuso determinar la capacidad de producir
biopelícula en aislamientos de S. aureus.
Se estudiaron 30 aislados (13 sensibles y 17 resistentes a meticilina) mediante
ensayo sobre microplacas de cultivos celulares. Todas las cepas mostraron
patrones de adherencia; 24 (80%), 4 (13%) y 2 (7%) exhibieron grados de
adherencia moderado, débil y fuerte, respectivamente. 77% de las cepas
sensibles resultaron moderadamente productoras, 13% débiles y 7% fuertes
productoras de biopelícula. Las cepas resistentes presentaron mayormente
moderada producción (82%) y el 18% débil producción. No hubo asociación entre
el grado de adherencia y la susceptibilidad a la meticilina. La alta tasa de
producción de biopelícula en cepas clínicas de S. aureus, sensibles y resistentes a meticilina, sugiere el peligro
potencial que representan dichas cepas dentro y fuera de ambientes
hospitalarios, dada la importancia que juegan las biopelículas en el desarrollo
de infecciones crónicas.
Palabras clave: Staphylococcus aureus, biopelícula, resistencia a la
meticilina
Abstract
The
formation of biofilm is a life strategy for most bacteria, since it increases
the possibilities of transfer of genetic material and resistance to
antibiotics, participates in cellular communication and offers protection in
adverse and variable environmental conditions; what contribute to a successful
colonization of the host. This research aimed to determine the capacity to
produce biofilm in isolates of S. aureus.
Thirty isolates (13 sensitive and 17 resistants to methicillin) were studied by
assay on cell culture microplates. All strains showed adherence patterns; 24
(80%), 4 (13%) and 2 (7%) exhibited degrees of moderate, weak and strong
adhesion, respectively. 77% of sensitive strains were moderately productive,
13% weak and 7% strong producers of biofilm. The resistant strains presented a
moderate production (82%) and 18% a weak production. There was no association
between the degree of adherence and the susceptibility to methicillin. The high
rate of biofilm production in clinical strains of S. aureus, sensitive and resistant to methicillin, suggests the
potential danger posed by such strains inside and outside hospital
environments, given the importance that biofilms play in the development of
chronic infections.
Keywords: Staphylococcus. aureus, biofilm, methicillin
resistant
Recibido 05-11-2018 / Aceptado 04-03-2019 / Publicación en línea 18-03-2019
Introducción
Varias especies bacterianas patógenas que se encuentran en el medio
ambiente son capaces de formar una estructura multicelular compleja en las
superficies, conocida como biopelícula o biofilm. Las biopelículas protegen las
células no sólo de la respuesta inmunitaria del hospedero, sino también de
agentes antimicrobianos (1).
Una biopelícula es un conjunto de células microbianas asociadas a la
superficie, que está encerrado en una matriz de sustancia polimérica
extracelular. Las bacterias incrustadas en un biofilm son más resistentes a los
antimicrobianos a través de varios mecanismos: la penetración total de
antimicrobianos es pobre, dependiente del crecimiento, tienen una eficacia
menor debido a la disminución del metabolismo de las bacterias y el intercambio
de genes de resistencia es más fácil por la proximidad de las células. La
formación de células persistentes, una subpoblación de bacterias que sobreviven
al tratamiento antimicrobiano, es también un factor contribuyente (2-4).
Las infecciones relacionadas con biopelículas, característicamente
infecciones crónicas, persistentes, refractarias a tratamiento antimicrobiano,
son un importante problema sanitario ya que representan entre un 65 y un 80% de
todas las infecciones. Estas se pueden localizar en casi cualquier tejido del
cuerpo humano, destacando la infección crónica de piel y partes blandas, las
infecciones pulmonares en los pacientes con fibrosis quística o bronquiectasias
o la endocarditis. Además, las biopelículas causan infecciones relacionadas con
diversos dispositivos biomédicos. En general, estas infecciones son difíciles
de diagnosticar y tratar, existiendo en la actualidad muchas dudas en cuanto a
la estrategia terapéutica óptima para estos pacientes (5).
Staphylococcus aureus es una causa común de infecciones mediadas
por la formación de biofilm, asociadas con catéteres intravenosos, válvulas
cardíacas artificiales y articulaciones protésicas. La habilidad de este
patógeno nosocomial para formar biopelículas es de interés clínico, ya que la
formación de biopelículas lo hace más resistente a los antibióticos y a las
defensas del hospedero, por lo tanto, influye en el resultado posterior de la
infección. Además, los dispositivos colonizados pueden convertirse en focos
importantes y pueden causar infecciones localizadas y generalizadas (6).
Staphylococcus aureus ha asegurado su éxito como un patógeno
importante en todo el mundo a través de su versatilidad, factores de virulencia
y mecanismos de resistencia. Las infecciones invasivas por S. aureus tienen una alta tasa de mortalidad y las producidas por S. aureus resistente a meticilina (SARM)
tienen resultados aún peores (7). Es una bacteria considerada como oportunista,
debido a que ocasiona enfermedades al humano, principalmente cuando éste
atraviesa lapsos de vulnerabilidad asociados a circunstancias anómalas que
disminuyen la competencia de su sistema inmunológico. Bajo tales condiciones,
el microorganismo es capaz de provocar afecciones en casi cualquier región
anatómica, lo cual refleja su amplio bagaje en cuanto a genes de virulencia que
lo habilita para establecerse, reproducirse, sobrevivir y diseminarse en
diversas clases de tejidos (8).
Se ha especulado
que SARM pueda ser más virulento que S. aureus sensible a meticilina
(SASM), pero no se ha podido demostrar por ahora. Incluso ciertos autores
opinan lo contrario, ya que el gasto biológico que este cambio supone iría en
detrimento de su virulencia. La superior mortalidad de SARM observada en algunos
estudios, se ha relacionado con la mayor comorbilidad de los pacientes
infectados, el retraso en el tratamiento adecuado y la menor disponibilidad de
antibióticos apropiados para estos estafilococos (9).
El propósito de
esta investigación fue conocer la habilidad para producir biopelícula de 30
cepas de S. aureus sensibles y resistentes a meticilina, aisladas de
muestras clínicas de pacientes del Servicio autónomo Hospital Universitario de
Maracaibo.
Métodos
Tipo y diseño de investigación: la presente es una investigación descriptiva con un diseño de campo no
experimental, la cual consiste en la recolección de datos directamente de la
realidad donde ocurren los hechos, sin manipulación deliberada de las
variables.
Población y muestra: se estudiaron 30 cepas de S.
aureus aisladas de diferentes tipos de muestras clínicas de pacientes del
Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM), tales cepas
fueron caracterizadas genéticamente de acuerdo a la presencia o no del gen mecA (17 SARM y 13 SASM).
Metodología: a todas las cepas de S. aureus
se les investigó la capacidad de producción de biopelícula, a través de un
ensayo fenotípico cuantitativo utilizando un método sobre microplacas de
cultivos celulares (10). Como cepa control positiva
(productora de biopelícula) se utilizó la cepa S. aureus ATCC® 25923.
Para cuantificar la
adherencia, las microplacas se llevaron a un lector de ELISA (Biorad®, modelo
680) para medir la densidad óptica de cada uno de los pozos, incluyendo el
control negativo (DOc), a una longitud de onda de 630 nm (DO630). Los valores
promedios de DO630 de los triplicados obtenidos de cada cepa, se consideraron
como el índice de adherencia bacteriana.
Los intervalos
discriminatorios para cuantificar el poder de adherencia y formación de biopelícula
sobre las microplacas de cultivo de tejido celular se calcularon siguiendo los
criterios de Manijeh y col. (11), con ligeras
modificaciones:
En los casos donde
se cumplió que DO630 ≤ DOc; se consideró la cepa como no productora de
biopelícula; cepas con valores ≤ 0,077
En los casos donde
se cumplió que DOc < DO630 ≤ 2(DOc); se consideró la cepa como débil
productora de biopelícula; cepas con valores entre 0,078 y 0,154.
En los casos donde
se cumplió que 2(DOc) < DO630≤ 3(DOc); se consideró la cepa como
moderadamente productora de biopelícula; cepas con valores entre 0,155 – 0,231.
En los casos donde
se cumplió que 3(DOc) < DO630; se consideró la cepa como fuerte productora
de biopelícula, cepas con valores ≥ 0,232
Análisis de resultados: los datos obtenidos fueron analizados en forma porcentual, y
organizados en tablas y gráficos. La asociación entre el grado de producción de
biofilm y la susceptibilidad a la meticilina se determinó mediante la
aplicación del estadístico c2 con un
grado de confiabilidad del 95%; por lo tanto, se consideraron estadísticamente
significativos los valores de p iguales o inferiores a 0,05 (p≤0,05). Se
empleó el Software estadístico SPSS (Statistical Package for Social Sciences),
versión 19.
Resultados
La cuantificación de
la capacidad de adherencia de los 30 aislados clínicos de S. aureus utilizando
el método sobre microplacas de cultivos celulares, mostró que la
totalidad de las cepas (100%) presentó algún grado de producción de biopelícula.
La dispersión de los 30 aislamientos de S. aureus de acuerdo a la DO630, se presenta en la Figura 1, clasificándose según el grado de adhesión en débil productoras (DP), moderadas productoras (MP) y fuertes productoras (FP) de biopelícula; así se observa que, 4 cepas se ubicaron dentro del espectro de débil producción con valores de DO entre 0,127 y 0,154; 2 cepas se mostraron como fuertes productoras ubicándose entre DO de 0,237 y 0,250 y 24 aislamientos registraron DO entre 0,155 y 0,220 clasificándose como moderadas productoras de biopelícula.
Figura 1. Dispersión de las
cepas de S. aureus productoras
de biopelícula según densidad óptica a 630nm
DO630 nm:
densidad óptica de 630 nm. DP: Débiles productoras de biopelícula. MP: Moderada
producción de biopelícula. FP: Fuertes productoras de biopelícula.
La Figura
2 muestra la distribución de las 30 cepas de S. aureus de acuerdo al grado de adhesión en las placas de
poliestireno, observándose que, 80% (24) de los aislados mostraron un patrón de
producción moderada, 13% (4) resultaron débil productoras y solo dos cepas (7%)
se presentaron como fuertes productoras de biopelícula.
Figura 2. Distribución de
las cepas de S. aureus según su grado de producción de biofilm
El número de cepas productoras de biofilm para cada grupo en estudio (SASM y SARM) puede observarse en la Figura 3, encontrándose que, las 13 cepas de SASM se distribuyeron de la siguiente manera: 1 (8%) DP, 10 (77%) MP y 2 (15%) FP; mientras que, los 17 aislados de SARM correspondieron a: 14 (82%) MP y 3 (18%) DP, respectivamente.
Figura 3. Producción de
biopelícula en cepas de S. aureus sensibles y resistente a meticilina
SASM: Staphylococcus aureus
sensible a meticilina. SARM; Staphylococcus
aureus resistente a meticilina
Al aplicar el
estadístico X2 para
determinar si existía o no asociación significativa entre la susceptibilidad a
la meticilina y el grado de producción de biopelícula, se obtuvo un valor
p>0,05, lo cual indica que el grado de formación de biofilm no está asociado
a la sensibilidad o resistencia a la meticilina.
En este estudio,
tanto las cepas de SASM como las de SARM, mostraron tendencia a la producción
moderada de biofilm, 77% y 82%, respectivamente (Figura 3).
Discusión
Las infecciones
asociadas a biopelículas causadas por S.
aureus son una causa importante de morbilidad y mortalidad (7).
En este estudio, la totalidad de las cepas estudiadas mostraron algún patrón de
adherencia a las placas de poliestireno. Este resultado coincide con lo
reportado por otros autores, quienes en diferentes investigaciones con cepas
clínicas de S. aureus informan
porcentajes de formación de biopelículas que oscilan entre 83,3 y 100 % (12-20). Índices de adhesión inferiores en
placas de poliestireno o formación de biopelículas, son reportados por otros
investigadores. Así, Kwon y col. 2008 (21) al estudiar la
producción de biopelículas en 101 aislamientos de S. aureus multidrogo-resistentes, se encontró que solo un 29,7 % de
las cepas fueron capaces de formar biopelículas. Naicker y col. (2)
y Khoramian y col. (22), obtuvieron 57 % y 58,4 % de
positividad, respectivamente.
La distribución de
las 30 cepas de S. aureus de acuerdo
al grado de adhesión en las placas de poliestireno: 80% con patrón de producción
moderada, 13% como débil productoras y 7% fuertes productoras, son resultados
similares a los reportados por Rahimi y col. (23) y Smith y
col. (15), quienes observaron un predominio de cepas de S. aureus con patrón de adhesión
moderado en las placas de poliestireno; pero difieren de lo informado por
Emaneini y col. (19) y Gad y col. (12)
que consiguieron un mayor número de cepas con fuerte poder adherente; mientras
que, Ávila y col. (18), al estudiar la producción de
biopelículas en aislados clínicos de SARM, detectaron un mayor porcentaje de
cepas con débil poder adherente; lo cual deja de manifiesto la gran
variabilidad reportada en la literatura sobre la capacidad de los aislados
clínicos de S. aureus, sensibles o
resistentes a meticilina, para producir biopelículas en diferentes grados.
En cuanto a la
relación de la susceptibilidad a la meticilina y la formación de biopelícula,
pudo observarse que tanto las cepas de SASM como SARM, mostraron diversos
grados de adhesión a las placas de poliestireno, encontrándose, para las 13
cepas de SASM: 1 (8%) DP, 10 (77%) MP y 2 (15%) FP; mientras que, para 17
aislados de SARM: 14 (82%) resultaron MP y 3 (18%) DP (Figura 3).
Otros estudios (2,15,17)
reportan hallazgos similares, observando patrones variados de producción de biopelícula,
tanto en cepas sensibles como resistentes a meticilina. No se observó
asociación significativa entre la susceptibilidad a la meticilina y el grado de
producción de biopelícula, lo cual coincide con lo informado por Gil M. y col. (14), quien en una investigación para determinar la formación de
biofilm en aislados clínicos de S. aureus
según susceptibilidad y procedencia clínica, pudo constatar que no había
asociación entre la susceptibilidad de las cepas a meticilina y el grado de
formación de biopelícula. De igual forma, otros autores informan diferencias no
significativas en la producción de biopelícula entre SASM y SARM (15,24,25).
En esta
investigación, tanto las cepas de SASM como las de SARM, mostraron tendencia a
la producción moderada de biopelícula, 77% y 82%, respectivamente. Gil M. y
col. (14) reportan una mayor proporción de cepas de SASM
débilmente formadoras de biopelícula; mientras que, las resistentes no
mostraron una inclinación específica, ubicándose entre un grado débil y moderado.
La alta tasa de
producción de biofilm en cepas clínicas de S.
aureus, independientemente de la sensibilidad o resistencia a meticilina,
sugieren el peligro potencial que representan dichas cepas dentro y fuera de
ambientes hospitalarios, dada la implicación e importancia que juegan las
biopelículas en el desarrollo de infecciones crónicas refractarias a terapias
antimicrobianas.
Conflicto de Intereses
Los autores declaran no presentar conflictos de intereses.
Referencias
Bibliográficas