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13th World Bu󰀨alo Congress ~ 13er Congreso Mundial de Búfalos / Posters / Biotechnology & Omics Technologies ____________________
Explorando el papel funcional de POU5F1 utili-
zando la electroporación CRISPR RNP de cigoto
(CRISPR-EZ) en búfalos
Meeti Punetha*, Dharmendra Kumar, Suman Choudhary,
Sheetal Saini, Kamlesh Kumari Bajwa, Surabhi Sharma,
Manu Mangal, P. S. Yadav, T. K. Datta
División de Fisiología y Reproducción Animal, ICAR-Instituto
Central de Investigación sobre Búfalos, Hisar 125001,
Haryana, India
*Autor de correspondencia: Meeti Punetha (meetipunetha283@gmail.com).
RESUMEN
POU5F1, un factor de transcripción clave, desempeña
un papel fundamental en el mantenimiento de la pluripotencia
y la diferenciación celular, lo que lo hace de inmenso interés en
la biología del desarrollo y la cría de animales. En el presente
estudio, empleamos la metodología de electroporación de ci-
gotos (CRISPR-EZ) de ribonucleoproteína CRISPR (RNP) de
última generación para manipular con precisión el gen POU5F1
en cigotos de búfalo para explorar los resultados fenotípicos y
Exploring the functional role of POU5F1 using
CRISPR RNP electroporation of zygote (CRIS-
PR-EZ) in bu󰀨aloes
Meeti Punetha*, Dharmendra Kumar, Suman Choudhary,
Sheetal Saini, Kamlesh Kumari Bajwa, Surabhi Sharma,
Manu Mangal, P. S. Yadav, T. K. Datta
Animal Physiology and Reproduction Division, ICAR-Central
Institute for Research on Buffaloes, Hisar 125001, Haryana,
India
*Corresponding author: Meeti Punetha (meetipunetha283@gmail.com).
ABSTRACT
POU5F1, a key transcription factor, plays a pivotal role in
maintaining pluripotency and cellular di󰀨erentiation, making it
of immense interest in developmental biology and animal hus-
bandry. In the present study, we employ state-of-the-art CRIS-
PR ribonucleoprotein (RNP) electroporation of zygotes (CRIS-
PR-EZ) methodology to precisely manipulate the POU5F1 gene
in bu󰀨alo zygotes for exploring the phenotypic and functional
outcomes of embryonic development. Through a combination
BOT-256 Rev. Cientif. FCV-LUZ, XXXIII, SE, 290-291, 2023, https://doi.org/10.52973/rcfcv-wbc132
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______________________________________________________ Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, Supl. Esp., 279 - 291, 2023
of strategies, we found that electroporation of bu󰀨alo zygote at
20V/mm, ve pulses, 3 msec at 10 h post-insemination (hpi)
resulted in greater membrane permeability and higher editing
e󰀩ciency (88.71%) without a󰀨ecting embryonic developmen-
tal potential. We targeted the bu󰀨alo POU5F1 gene using the
abovementioned parameters, which caused nonsense-medi-
ated mRNA decay and led to complete knockout (KO) of the
POU5F1 gene. We analyzed the mutation rates and mosaic
mutations using tracking of Indels by decomposition (TIDE)
software. We observed no di󰀨erence in the embryonic devel-
opmental competence at cleavage or blastocyst rate between
control, POU5F1-KO, and electroporated control embryos. We
determined the expression of SOX2, Nanog, and GATA2 in
POU5F1 intact (Control) and POU5F1-KO conrmed blasto-
cyst to better understand the impact of POU5F1-KO on other
pluripotent genes. POU5F1-KO signicantly (p<0.05) altered
SOX2, Nanog, and GATA2 expression in blastocyst-stage em-
bryos. In conclusion, direct electroporation of the CRISPR RNP
component to the earlier stage of the zygote e󰀩ciently created
mutations in the POU5F1 gene. We developed an easy and
straightforward protocol for gene editing, which could serve as
a valuable method for studying the functional genomics of the
bu󰀨alo embryos.
Keywords: RNP, electroporation, zygotes, bu󰀨alo, POU5F1.
funcionales del desarrollo embrionario. A través de una com-
binación de estrategias, encontramos que la electroporación
del cigoto de búfalo a 20 V/mm, 5 pulsos, 3 ms a las 10 h
post-inseminación (hpi) resultó en una mayor permeabilidad de
la membrana y una mayor eciencia de edición (88,71%) sin
afectar el potencial de desarrollo embrionario. Nos dirigimos al
gen POU5F1 de búfalo utilizando los parámetros mencionados
anteriormente, lo que provocó una descomposición del ARNm
mediada sin sentido y condujo a una desactivación completa
(KO) del gen POU5F1. Analizamos las tasas de mutación y las
mutaciones en mosaico utilizando el software de seguimiento
de Indels por descomposición (TIDE). No observamos diferen-
cias en la competencia de desarrollo embrionario en la tasa de
escisión o blastocisto entre los embriones del grupo control,
POU5F1-KO y los de control electroporados. Determinamos
la expresión de SOX2, Nanog y GATA2 en POU5F1 intacto
(Control) y en blastocisto conrmado con POU5F1-KO para
comprender mejor el impacto de POU5F1-KO en otros genes
pluripotentes. En embriones en etapa de blastocisto, POU5F1-
KO alteró signicativamente (p<0,05) la expresión de SOX2,
Nanog y GATA2. En conclusión, la electroporación directa del
componente CRISPR RNP en la etapa anterior del cigoto fue
ecaz para crear mutaciones en el gen POU5F1. Desarrolla-
mos un protocolo sencillo y directo para la edición de genes,
que podría servir como un método valioso para estudiar la ge-
nómica funcional de los embriones de búfalo.
Palabras clave: RNP, electroporación, cigotos, búfalo,
POU5F1.