262
13th World Bu󰀨alo Congress ~ 13er Congreso Mundial de Búfalos / Posters / Reproduction _______________________________________
Las vesículas extracelulares (EV) en el plasma se-
minal de los toros búfalo poseen proteínas y en-
zimas asociadas a la fertilidad especícas de los
espermatozoides
Rakesh Kumar*, Mir Ahmad, Bala Subramaniam,
Ankit Pal, Aditya Patel, Shiva Shiva, Vitika Chauhan,
Seema Karanwal, Mukesh Bhakat, Tirtha K. Datta
ICAR- Instituto Nacional de Investigación Láctea, Karnal,
Haryana, INDIA
*Autor de correspondencia: Rakesh Kumar (rakesh.kumar@icar.gov.in).
RESUMEN
Los búfalos son la columna vertebral de la industria ga-
nadera y láctea de la India. Contribuyen con casi el 53% de
la producción de leche y el 30% de la producción de carne en
Extracellular vesicles (EVs) in seminal plasma
of bu󰀨alo bulls possess spermatozoa specic
fertility associated proteins and enzymes
Rakesh Kumar*, Mir Ahmad, Bala Subramaniam,
Ankit Pal, Aditya Patel, Shiva Shiva, Vitika Chauhan,
Seema Karanwal, Mukesh Bhakat, Tirtha K. Datta
ICAR- National dairy Research Institute, Karnal, Haryana,
INDIA
*Corresponding author: Rakesh Kumar (rakesh.kumar@icar.gov.in).
ABSTRACT
Bu󰀨aloes are the backbone of the Indian dairy and live-
stock industry. They contribute nearly 53% of milk and 30% of
meat production in India. Bull fertility is vital to productivity, sus-
tainability, and e󰀩cient bu󰀨alo farming. The current study aims
R-174 Rev. Cientif. FCV-LUZ, XXXIII, SE, 262-263, 2023, https://doi.org/10.52973/rcfcv-wbc111
263
______________________________________________________ Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, Supl. Esp., 240 - 278, 2023
to assess the extracellular vesicles (EVs) based fertility marker
in the seminal plasma of bu󰀨alo bulls. The seminal plasma of
bu󰀨alo bulls of contrasting fertility was utilized to purify EVs
by size exclusion chromatography (SEC). Di󰀨raction light scat-
tering (DLS), nano-tracking assay (NTA), and Western blotting
were used to conrm seminal plasma EVs. A pure population
of EVs was obtained in 7-12 SEC fractions with an average EV
size of 161nm. The NTA analysis provides a quantitative abun-
dance of EVs, and the EVs population was 1.5x109 to 2.9x1011
EVs/ml in seminal plasma. Utilizing the Western blotting ap-
proach, the abundance of SPAM-1 protein in EVs was signi-
cantly high in high fertile (HF) bulls as compared to low fertile
(LF) group (p <0.05). However, disintegrin and metalloprotein-
ase domain-containing protein 7 (ADAM-7) and acrosomal
protein SP-10 were not signicantly di󰀨erent in seminal EVs
of HF and LF bulls. Similarly, the abundance of Gelectin-3 and
aldose reductase (AR) was comparatively higher in HF groups,
although it was insignicant. The fertility factor, CD9 protein,
was signicantly abundant in the seminal EVs of HF vis a vis
LF bu󰀨alo bulls, suggesting that CD9 of seminal EVs origin
could help assess the fertility status of bu󰀨alo bulls. Enzymatic
phospholipase A2 (PLA2) activity in HF was higher than in LF
seminal EVs, indicating superior PLA2 activity in highly fertile
bull semen. Uptake of EV-associated fertility proteins by sper-
matozoa was assessed. We observed that protein cargo was
successfully assimilated with sperm. Finally, LC-MS/MS-based
high throughput proteome was performed to identify the di󰀨er-
ential abundance of protein cargo in seminal EVs of contrasting
fertility bulls. We identied the top twenty di󰀨erently abundant
proteins in seminal EVs of HF bulls vis-à-vis LF bulls. The iden-
tied proteins were strongly related to sperm functions. Thus,
the present study supports that bu󰀨alo seminal EVs possess
vital fertility-associated proteins and enzymes, which could be
important markers for assessing bu󰀨alo bull fertility.
Keywords: extracellular vesicles, seminal plasma, fertility, pro-
tein.
la India. La fertilidad de los toros es vital para la productivi-
dad, la sostenibilidad y la cría eciente de búfalos. El presente
estudio tuvo como objetivo evaluar el marcador de fertilidad
basado en vesículas extracelulares (EV) en el plasma seminal
de toros búfalinos. El plasma seminal de búfalos de fertilidad
contrastante se utilizó para puricar vesículas extracelulares
mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se
utilizaron dispersión de luz por difracción (DLS), ensayo de na-
noseguimiento (NTA) y Western Blot para conrmar las EV del
plasma seminal. Se obtuvo una población pura de vesículas
extracelulares en fracciones de 7 a 12 SEC con un tamaño de
vesículas extracelulares promedio de 161 nm. El análisis NTA
proporciona una abundancia cuantitativa de EV, y la población
de EV fue de 1,5 x 109 a 2,9 x 1011 EV/ml en plasma seminal.
Utilizando el método de transferencia Western, la abundancia
de la proteína SPAM-1 en las vesículas extracelulares fue sig-
nicativamente alta en los toros de alta fertilidad (HF) en com-
paración con los del grupo de baja fertilidad (LF) (p<0,05). Sin
embargo, la proteína 7 que contiene el dominio de desintegrina
y metaloproteinasa (ADAM-7) y la proteína acrosómica SP-10
no fueron signicativamente diferentes en las EV seminales de
toros HF y LF. De manera similar, la abundancia de Gelectina-3
y aldosa reductasa (AR) fue comparativamente mayor en los
grupos con HF, aunque fue insignicante. El factor de fertili-
dad, la proteína CD9, fue signicativamente abundante en las
vesículas extracelulares seminales de los toros búfalo HF en
comparación con los búfalos LF, lo que sugiere que el CD9 de
origen de las vesículas extracelulares seminales podría ayudar
a evaluar el estado de fertilidad de los búfalos. La actividad
enzimática de la fosfolipasa A2 (PLA2) en HF fue mayor que
en las EV seminales de LF, lo que indica una actividad de PLA2
superior en semen de toro altamente fértil. Se evaluó la ab-
sorción de proteínas de fertilidad asociadas a EV por parte de
los espermatozoides. Observamos que la carga proteica fue
asimilada exitosamente por los espermatozoides. Finalmente,
se realizó un proteoma de alto rendimiento basado en LC-MS/
MS para identicar la abundancia diferencial de la carga de
proteínas en vesículas extracelulares seminales de toros de
fertilidad contrastante. Identicamos las veinte proteínas con
abundancia diferente en las vesículas extracelulares semina-
les de toros HF frente a toros LF. Las proteínas identicadas
estaban fuertemente relacionadas con las funciones de los es-
permatozoides. Por lo tanto, el presente estudio respalda que
las vesículas extracelulares seminales de búfalos poseen pro-
teínas y enzimas vitales asociadas a la fertilidad, que podrían
ser marcadores importantes para evaluar la fertilidad de los
búfalos.
Palabras clave: vesículas extracelulares, plasma seminal, fer-
tilidad, proteínas.