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______________________________________________________ Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, Supl. Esp., 213 - 239, 2023
Experimental use of mycobacterial antigens in
tuberculin skin test on water bu󰀨alo
Alessandra Martucciello1, Federica Signorelli 2,
Piera Mazzone3, Francesco Grandoni 2,
Giovanna Cappelli 1*, Lucia Boccia4, Giuseppe Parente4,
Monica Cagiola3, Maria Beatrice Boniotti 5,
Esterina De Carlo1, Francesco Napolitano2,
Giorgio Galiero1
1 National Reference Centre for Hygiene and Technology
of Breeding and Buffalo Production, Istituto Zooprolattico
Sperimentale del Mezzogiorno, Salerno, Italy.
2 Council for Agricultural Research and Economics - Animal
Production and Aquaculture, Monterotondo, Italy.
3 Istituto Zooprolattico Sperimentale dell’Umbria e delle
Marche “Togo Rosati”, Perugia, Italy.
4 Azienda Sanitaria Locale Salerno, Salerno, Italy.
5 National Reference Centre for Bovine Tuberculosis, Istituto
Zooprolattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia
Romagna, Brescia, Italy.
*Corresponding author: Giovanna Cappelli
(giovanna.cappelli@izsmportici.it).
ABSTRACT
In Italy, bovine tuberculosis (TB) control in the water buf-
falo population is mainly carried out using the tuberculin skin
test (TST). The test measures the increase in skin thickness
72 hours (h) after the intradermal injection of mycobacterial pu-
ried protein derivatives (PPD). The TST can involve the single
intradermal test with bovine PPD (PPDB), or the comparative
test adding a second injection with avian tuberculin (PPDA),
using the couple of PPDs reduces false positives caused by
non-tuberculosis mycobacteria. This pilot study aimed to eval-
uate the potential use of PPDB, PPDA, along with 6 kDa early
secretory antigenic target (ESAT-6), 10 kDa culture ltrate pro-
tein (CFP-10), and Early Secretory Proteins (ESP) in the TST,
in healthy and naturally TB infected bu󰀨aloes. Twenty-one buf-
faloes, gamma-interferon (IFN-γ) test positive, from a TB-out-
break herd and 11 bu󰀨aloes from a TB-free herd were select-
ed. All subjects were also submitted to the IFN-γ test using the
same antigens (Ag) as the TST to verify the cellular response
in vitro and to exclude anaergic animals that did not respond to
in vitro stimulation with the mitogen. The TST was performed
according to the TB Italian National eradication program, and to
Reg. EU 2020/689. Eight intradermal injection sites were used
on each animal shoulder (4 on the right and 4 on the left side).
Three concentrations of the ESAT6-CFP10 protein cocktail (10,
20 and 30 µg) and two of ESP (50 and 100 µg) were inoculated.
PPDB and PPDA were always included in the TST, along with
PBS as negative control. Skin reactions were measured with
Uso experimental de antígenos micobacterianos
en la prueba cutánea de tuberculina en búfalos de
agua
Alessandra Martucciello1, Federica Signorelli2,
Piera Mazzone3, Francesco Grandoni2,
Giovanna Cappelli1*, Lucia Boccia4, Giuseppe Parente4,
Monica Cagiola3, Maria Beatrice Boniotti5,
Esterina De Carlo1, Francesco Napolitano2,
Giorgio Galiero1
1 Centro Nacional de Referencia para la Higiene y Tecnología
de la Cría y Producción del Búfalo, Istituto Zooprolattico
Sperimentale del Mezzogiorno, Salerno, Italia.
2 Consejo de Investigación y Economía Agrícola - Producción
Animal y Acuicultura, Monterotondo, Italia.
3 Istituto Zooprolattico Sperimentale dell’Umbria e delle
Marche “Togo Rosati”, Perugia, Italia.
4 Azienda Sanitaria Locale Salerno, Salerno, Italia.
5 Centro Nacional de Referencia para la Tuberculosis Bovina,
Istituto Zooprolattico Sperimentale della Lombardia e
dell’Emilia Romagna, Brescia, Italia.
*Autor de correspondencia: Giovanna Cappelli
(giovanna.cappelli@izsmportici.it).
RESUMEN
En Italia, el control de la tuberculosis bovina (TB) en la
población de búfalos de agua se lleva a cabo principalmente
mediante la prueba cutánea de la tuberculina (PT). La prueba
mide el aumento del grosor de la piel 72 horas (h) después
de la inyección intradérmica de derivados proteicos puricados
(PPD) de micobacterias. La PT puede implicar la prueba intra-
dérmica única con PPD bovino (PPDB), o la prueba compara-
tiva añadiendo una segunda inyección con tuberculina aviar
(PPDA). El uso de un par de PPD reduce los falsos positivos
causados por micobacterias no tuberculosas. Este estudio pilo-
to tuvo como objetivo evaluar el uso potencial de PPDB, PPDA,
junto con un objetivo antigénico secretorio temprano de 6 kDa
(ESAT-6), una proteína ltrada de cultivo de 10 kDa (CFP-10)
y proteínas secretoras tempranas (ESP) en la TST, en búfalos
sanos y naturalmente infectados con tuberculosis. Se seleccio-
naron veintiún búfalos con resultados positivos para interferón
gamma (IFN-γ) de un rebaño con brote de tuberculosis y 11
búfalos de un rebaño libre de tuberculosis. Todos los sujetos
también fueron sometidos a la prueba de IFN-γ utilizando los
mismos antígenos (Ag) que la TST para vericar la respuesta
celular in vitro y excluir animales anaérgicos que no respondie-
ron a la estimulación in vitro con el mitógeno. La PT se realizó
según el programa nacional italiano de erradicación de la tu-
berculosis y el Reg. UE 2020/689. Se utilizaron ocho sitios de
inyección intradérmica en cada hombro de animal (4 en el lado
AHOH-175 Rev. Cientif. FCV-LUZ, XXXIII, SE, 225-226, 2023, https://doi.org/10.52973/rcfcv-wbc084
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13th World Bu󰀨alo Congress ~ 13er Congreso Mundial de Búfalos / Posters / Animal Health & One Health ___________________________
calipers before the test and every 24 h for 4 days. The TST was
considered positive in animals with an increase in skin thick-
ness between post and pre-dermal test readings of > 4 mm,
doubtful if between 2 and 4 mm, negative <2 mm. Negative
subjects also exhibited a skin response to PPDB at 24 and 48
h, but it became completely negative at 72 h, the prescribed
reading time. In the positive bu󰀨aloes, the kinetics of skin re-
sponses showed that the strongest response was to PPDB at
24h, with some subjects becoming doubtful at 72 and 96 h. A
peak response was observed at 48 hours to PPDA and to 20 µg
of the ESAT6-CFP10 protein cocktail, followed by a decrease.
The response to ESP-100 µg remained high at 24 and 48 h
and then decreased, remaining positive at 72 h. ESP showed
the best performance with higher reactivity in positive animals
and no reactivity in negative animals at 72 h. Therefore, ESP
could be an excellent candidate for further extensive studies in
the bu󰀨alo species to improve TST Sensitivity and Specicity.
Keywords: water bu󰀨alo, tuberculosis, diagnosis, tuberculin
skin test.
Funding: This work was supported by RC IZSME 09/19 Fi-
nanced by the Italian Ministry of Health.
derecho y 4 en el lado izquierdo). Se inocularon tres concentra-
ciones del cóctel proteico ESAT6-CFP10 (10, 20 y 30 µg) y dos
de ESP (50 y 100 µg). PPDB y PPDA siempre se incluyeron en
la TST, junto con PBS como control negativo. Las reacciones
cutáneas se midieron con calibradores antes de la prueba y
cada 24 h durante 4 días. La PT se consideró positiva en ani-
males con un aumento del espesor de la piel entre las lecturas
de la prueba post y predérmica de > 4 mm, dudoso si entre 2
y 4 mm, negativo < 2 mm. Los sujetos negativos también mos-
traron una respuesta cutánea al PPDB a las 24 y 48 h, pero se
volvió completamente negativa a las 72 h, el tiempo de lectura
prescrito. En los búfalos positivos, la cinética de las respuestas
de la piel mostró que la respuesta más fuerte fue al PPDB a las
24 h, y algunos sujetos se volvieron dudosos a las 72 y 96 h.
Se observó una respuesta máxima a las 48 horas con PPDA y
con 20 µg del cóctel de proteínas ESAT6-CFP10, seguida de
una disminución. La respuesta a ESP-100 µg se mantuvo alta
a las 24 y 48 h y luego disminuyó, permaneciendo positiva a
las 72 h. ESP mostró el mejor desempeño con mayor reactivi-
dad en animales positivos y ninguna reactividad en animales
negativos a las 72 h. Por lo tanto, ESP podría ser un excelente
candidato para estudios más extensos en la especie de búfalo
para mejorar la sensibilidad y especicidad de la TST.
Palabras clave: búfalo de agua, tuberculosis, diagnóstico,
prueba cutánea de tuberculina.
Financiamiento: Este trabajo fue apoyado por RC IZSME
09/19 Financiado por el Ministerio de Salud italiano.