https://doi.org/10.52973/rcfcv-e34378
Recibido: 15/01/2024 Aceptado: 22/03/2024 Publicado: 27/07/2024
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Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIV, rcfcv-e34378
RESUMEN
La Ehrlichiosis monocítica canina (EMC), una enfermedad
emergente causada por Ehrlichia canis. Este patógeno se encuentra
comúnmente en perros y otros canidos silvestres que actúan como
reservorios naturales. La EMC es prevalente en regiones tropicales
y subtropicales, por la presencia de la garrapata marrón del perro,
Rhipicephalus sanguineus, que actúa como vector principal, siendo
América Latina una región afectada. La enfermedad se maniesta
en tres etapas clínicas: aguda, subclínica y crónica, con síntomas
como depresión, letargo, anorexia, hemorragias, y cambios en los
parámetros hematológicos. El diagnóstico de E. canis puede ser a
través de pruebas serológicas y moleculares, siendo la PCR dirigida
al gen 16S rRNA considerada la técnica más able. El estudio se llevó
a cabo en perros con sintomatología clínica en una clínica veterinaria
en Ecuador. Se realizaron test de inmunocromatograa y reacción
de cadena de polimerasa para identicar la presencia de E. canis.
Se evidenció que las pruebas serológicas presentan una tasa de
positividad superior, pero pueden generar falsos positivos debido
al tiempo post infección. La PCR permite la detección temprana,
incluso en fases subclínicas, ofreciendo la posibilidad de iniciar el
tratamiento antes de la manifestación de síntomas. Se concluye
destacando la importancia de realizar combinación de pruebas de
laboratorio para un diagnóstico más able de la EMC en perros,
identificando precozmente caninos como posibles fuentes de
transmisión zoonótica de E. canis a los humanos.
Palabras clave: Ehrlichia canis; Rhipicephalus sanguineus; Caninos;
PCR; Inmunocromatografía
ABSTRACT
Canine Monocytic Ehrlichiosis (CME), an emerging disease caused
by Ehrlichia canis. This pathogen is commonly found in dogs and
other wild canids acting as natural reservoirs. CME is prevalent in
tropical and subtropical regions, due to the presence of the brown
dog tick, Rhipicephalus sanguineus, which acts as the main vector,
with Latin America being an affected region. The disease manifests in
three clinical stages: acute, subclinical, and chronic, with symptoms
such as depression, lethargy, anorexia, hemorrhages, and changes
in hematological parameters. The diagnosis of E. canis can be made
through serological and molecular tests, with PCR targeting the 16S
rRNA gene considered the most reliable technique. The study was
conducted on dogs with clinical symptoms at a veterinary clinic
in Ecuador. Immunochromatographic tests and polymerase chain
reaction were performed to identify the presence of E. canis. It was
evident that serological tests have a higher positivity rate but can
generate false positives due to post–infection time. PCR allows
early detection, even in subclinical phases, offering the possibility
of starting treatment before the manifestation of symptoms.
It is concluded by emphasizing the importance of performing a
combination of laboratory tests for a more reliable diagnosis of
CME in dogs, identifying dogs early as possible sources of zoonotic
transmission of E. canis to humans.
Key words: Ehrlichia canis; Rhipicephalus sanguineus; canines;
PCR; immunochromatography
Estudio molecular de Ehrlichiosis monocítica canina en la ciudad de
Machala, Ecuador
Molecular study of Canine monocytic Ehrlichiosis in the City of Machala, Ecuador
Stalin Yhovanny Correa–Vivanco
1
, Ana Elizabeth Guerrero–López
1,2
* , Lorena Elizabeth Chalco–Torres
2
, Robert Gustavo Sánchez Prado
2
,
Mauro Nirchio–Tursellino
2
1
Universidad Técnica de Machala, Programa de Maestría en Medicina Veterinaria. Machala, El Oro, Ecuador.
2
Universidad Técnica de Machala, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela de Medicina Veterinaria. Machala, El Oro, Ecuador.
*Autor para correspondencia: aguerrero@utmachala.edu.ec
Ehrlichiosis Monocítica canina en la ciudad de Machala, Ecuador / Correa-Vivanco y cols._________________________________________
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INTRODUCCIÓN
La Ehrlichiosis monocítica (EMC) canina es una enfermedad
infecciosa emergente causada por Ehrlichia canis [1]. Este patógeno
se identica con mayor frecuencia en perros domésticos, así como
en zorros, coyotes y chacales, que también son reconocidos como
reservorios naturales de este agente [2].
Esta patología es prevalente en regiones tropicales y subtropicales
a nivel mundial. Su existencia está vinculada al vector conocido como
la garrapata marrón del perro, Rhipicephalus sanguineus [1]. Esta
tendencia es notable en América Latina, donde se han identicado
diversos focos de infección causados por E. canis [3, 4, 5].
Esta enfermedad puede manifestarse en tres etapas clínicas:
aguda, subclínica y crónica [5, 6]. La presencia de diversos signos
clínicos, tales como depresión, letargo, anorexia, pérdida de peso y
propensión a hemorragias, son compatibles a EMC. Además, durante
la exploración física, se observan linfoadenomegalia y esplenomegalia
[6]. Sin embargo, los signos presentes en este cuadro clínico son
compartibles por varios agentes infecciosos, lo que complica la
identicación precisa de la enfermedad [7].
Ehrlichia canis provoca cambios en los parámetros hematológicos
de los perros, tales como anemia normocítica normocrómica,
trombocitopenia, linfocitosis y monocitosis, ya sea de manera aislada
o en combinación, acompañadas ocasionalmente de leucopenia [8,
9]. Investigaciones relatan que la trombocitopenia como una de las
alteraciones hematológicas más comunes en perros con infección
por E. canis [10]. Es importante señalar que la EMC es una zoonosis
emergente que puede transmitirse a los humanos a través de la
picadura de garrapatas infectadas [11].
Los métodos de diagnóstico presentan distintos niveles de
sensibilidad y especicidad, por lo que se debe elegir el más apropiado
según la sintomatología y el tiempo transcurrido desde la infección
[12]. Por esa razón deberíamos saber desde cuando presentaba signos
clínicos cada uno de los pacientes incluidos en el estudio, así como
los diferentes grupos etarios que participaron, las razas, pesos, si
todos eran autóctonos de las región, El análisis citológico posibilita la
observación de mórulas en extensiones de sangre periférica, aunque
su sensibilidad es baja, pudiendo aumentar al emplear la tinción de la
capa leucocitaria [13]. El cultivo celular, aunque altamente sensible
y conrmatorio, requiere un extenso periodo, aproximadamente un
mes, para arrojar resultados [14].
En contraste para el diagnóstico serológico, la técnica de
inmunouorescencia indirecta (IFI) es considerada una prueba oro
ya presenta una sensibilidad que oscila entre el 87 % y el 100 %, así
como una especicidad comprendida entre el 77 % y el 100. Dado que
la prueba de inmunouorescencia indirecta (IFA) requiere laboratorios
y equipos especializados, se han creado pruebas comerciales como
el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas y un ensayo de
inmunocromatografía rápida (ICA) con el objetivo de simplicar y agilizar
el diagnóstico serológico. Lamentablemente, los desafíos relacionados
con la reactividad cruzada aún representarían un obstáculo para
obtener un diagnóstico denitivo en estas pruebas [15].
Diversos estudios han identificado la Reacción de cadena de
polimerasa (PCR), especialmente el método de PCR dirigido al
16SrRNA como la técnica de laboratorio más able para diagnosticar
la infección por E. canis [16].
Estudios moleculares de E. canis en la región sur del Ecuador son
escasos debido a la frecuencia y endemicidad de la enfermedad es
necesario el empleo de métodos de diagnósticos más especícos
para E. canis por ello se establece como objetivo identicar mediante
técnica molecular E. canis en perros con sintomatología clínica
atendidos en la clínica docente de especialidades veterinarias de la
Universidad de Machala.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se llevó a cabo un estudio descriptivo, transversal en 478 pacientes
caninos atendidos en la clínica docente de especialidades veterinarias
de la Universidad de Machala durante los meses de abril a junio de
2023. La población de estudio comprendió 123 pacientes caninos,
mestizos de los cuales 70 eran machos y 53 hembras. Los criterios
de inclusión se basaron en la identicación durante la anamnesis y
exploración física de signos clínicos compatibles con EMC, como falta
de apetito, letargia, ataxia, debilidad, ebre, petequias, equimosis,
epistaxis, hemorragia en esclerótica presencia de garrapatas y un
periodo de evolución de los signos de 4 días (petequia, equimosis,
emesis, hemorragia en esclerótica, epistaxis ataxia, debilidad, etc).
Resultaría importante haber profundizado en la anamnesis de todos
los pacientes para indagar el periodo de tiempo durante el cual habían
presentado los síntomas y de esa forma tratar de establecer grupos
de los pacientes en fase aguda, subclínica y crónica
Para la obtención de muestras, se realizó una extracción de sangre
mediante punción aséptica de la vena cefálica, extrayendo 3 ml de
sangre, que se colocaron en tubos con el anticoagulante ácido
etilendiamino tetracético (EDTA). Posteriormente, se llevó a cabo
la determinación del hemograma de rutina utilizando el contador
hematológico (marca VETSCAN, modelo HM5, Zoetis, Hungría) un
contador de células compacto y totalmente automatizado diseñado
para el diagnóstico in vitro.
A los pacientes que presentaron signos clínicos y alteraciones
hematológicas sugestivas de EMC, se les realizaron pruebas de
inmunocromatografía Canivet–4 para Anaplasma/Ehrlichia/Lyme/
Dirolaria immitis. Aquellas muestras de pacientes que resultaron
positivos en la prueba serológica fueron refrigeradas y se procedió a
su almacenamiento a una temperatura de 5°C para su conservación,
con el propósito de llevar a cabo pruebas moleculares posteriormente.
Análisis Molecular
La muestra de sangre fue sometida de inmediato al protocolo de
extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico utilizando
el kit GenElute™ (Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit, Catálogo
N° G1N350, EUA), siguiendo las indicaciones proporcionadas por el
fabricante. La cantidad y pureza del extracto se evaluaron mediante
un equipo (Nanodrop 2000c de Thermo Fisher®, EUA).
Para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), se utilizaron
los cebadores ECP1: 5’–GGTAATACTGTATAATCCCC–3’ (directo)
y HE3: 5’–TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT–3’ (inverso), que
amplifican un fragmento del gen 16S rRNA de E. canis con una
temperatura de anillamiento de 50°C [17]. También se emplearon
los cebadores EEM2F (5–GGAGCTAAAATAGAAGATATTC–3) y EEM1R
(5–GTGCAAAAAGGTAATACA T–3) para amplicar un fragmento del
gen p28 de E. ewingii con una temperatura de anillamiento de 55°C.
TABLA I
Alteraciones Hematológicas y relación con pruebas
PCR y test de inmunocromatografía
Alteración
Hematológica
PCR positiva
(%)
PCR Negativa
(%)
ICA Positivo
(%)
ICA Negativa
(%)
Anemia
1
n = 8 (53,3) n = 7 (46,6) n = 16 (55,2) n = 13 (44,8)
Trombocitopenia
2
n = 12 (80) n = 3 (20) n = 20 (69) n = 9 (31)
Neutropenia
3
n = 4 (27) n = 11 (73) n = 2 (7) n = 27 (93)
Neutrolia
4
n = 3 (20) n = 12 (80) n = 4 (14) n = 25 (86)
Linfocitosis
5
n = 3 (20) n = 12 (80) n = 5 (17) n = 24 (83)
Linfopenia
6
n = 4 (27) n = 11 (73) n = 8 (28) n = 21 (72)
Monocitosis
7
n = 3 (20) n = 12 (80) n = 2 (7) n = 27 (93)
Monocitopenia
8
n =1 (7) n = 14 (93) n = 4 (14) n = 25 (86)
1: hematies < 5,5 × 10
12
·L
-1
|hematocrito < 37, 2: trombocitos < 150 × 10
9
·L
-1
, 3:
neutrólos < 3 × 10
9
·L
-1
, 4: neutrólos > 12 × 10
9
·L
-1
, 5: linfocitos > 4,8 × 10
9
·L
-1
, 6:
linfocitos < 1 × 10
9
·L
-1
, 7: monocitos > 1,35 × 10
9
·L
-1
, 8: linfocitos < 0,15 × 10
9
·L
-1
,
ICA: inmunocromatografía
FIGURA 1. Electroforesis con gel de agarosa al 1 % mostrando los productos de
amplicación con los cebadores ECP1 y HE3. Carril 1 mostrando un marcador de
peso molecular de 100 pares de bases, carril 1,3,5 pacientes positivos a E. canis
_____________________________________________________________________________Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIV, rcfcv-e34378
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La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de 20 μL, que
contenía: 12,8 μL de agua puricada, 2 μL de tampón de PCR 10×, 1 μL
de MgCl
2
(50 mM), 1 μL de dNTP (2 mM), 1 μL de cada cebador (5 mM),
0,2 μL de 1,25 unidades de Taq polimerasa, y 1 μL de ADN genómico
(50–100 ng·μL
–1
).
Los ciclos de PCR se llevaron a cabo según las siguientes
especicaciones: 95°C durante 2 min, seguidos de 30 ciclos de 94°C
por 30 s, 50–55°C por 1 min, 72°C por 1 min, y una extensión nal a 72°C
por 1 min [3, 15, 16]. La amplicación se realizó en un Termociclador
(Mastercycler Pro S, Eppendorf, Alemania).
Se procedió a conrmar la presencia de los productos amplicados
mediante la realización de electroforesis en gel de agarosa al 1 %,
utilizando tampón TAE. Para la visualización de los fragmentos, se
empleó un marcador de peso molecular de 100 pares de bases (pb)
de Sigma Aldrich y GelRed como tinte uorescente. La observación
de los amplicones y el marcador de referencia se llevó a cabo en un
transiluminador ultravioleta (UV) (UVP, M–V26, EUA).
RESULTADOS Y DISCUSION
De la totalidad de 123 pacientes que presentaron sintomatología a
E. canis en la clínica veterinaria UTMACH de acuerdo a los criterios
de inclusión planteados, 29 pacientes dieron positivos a la técnica
de ICA representando el 23,58 % la positividad de esta prueba nos
indica la presencia de anticuerpos contra la Ehrlichia, pudiendo
generar falsos positivos. (la positividad de esta prueba nos indica
la presencia de anticuerpos contra la ehrlichia, pudiendo generar
falsos positivos). Las 29 muestras sanguíneas positivas al test de
ICA fueron analizadas por el respectivo test molecular dando como
resultado 15 pacientes positivos.
Las alteraciones hematológicas encontradas fueron relacionadas con
los resultados del test serológico y molecular como lo muestra la Tabla I.
Se logró generar un producto de aproximadamente 393 pares
de bases (FIG. 1), utilizando los cebadores ECP1 y HE3, el cual
resultó ser más corto que los 495 pares de bases anticipados para
la amplicación del fragmento del gen 16S rARN de E. canis [19].
Además, se observó una banda tenue ligeramente superior a los
100 pares de bases, que se atribuye a la presencia de los propios
cebadores, tal como lo encontró otro estudio molecular [18].
En la actualidad, la importancia mundial de la EMC ha aumentado
signicativamente, principalmente porque la especie de garrapata
responsable de su transmisión R. sanguineus es reconocida como la
de mayor distribución geográca [19].
Las infecciones provocadas por E. canis son endémicas en áreas
geográcas tropicales y subtropicales, donde la población de la garrapata
portadora, R. sanguineus, está en aumento [20, 21]. La zona costera del
sur de Ecuador, en la cual se centró la investigación, se distingue por
su clima tropical, creando condiciones propicias para el desarrollo y la
presencia habitual del vector de la enfermedad, R. sanguineus .
En el examen de 29 muestras a través de PCR, se identicaron 15
casos positivos, equivalente al 52 %. Estos resultados concuerdan
con los descubrimientos en Naranjal, Ecuador, donde se observó
un porcentaje del 52.94 % de pacientes con resultados positivos
para EMC [22]. Sin embargo, estos datos dieren a los encontrados
en Nigeria 26 % [23], Tailandia 39,1 % [24], Colombia 15,3 % [25],
Paraguay 10.41 % [26].
Esta investigación respalda la noción de que los estudios serológicos
exhiben una tasa de positividad superior en comparación con los análisis
moleculares, corroborando descubrimientos previos en otros estudios
[27, 28]. No obstante, es crucial destacar la inuencia de las condiciones
climáticas en el lugar donde se lleva a cabo el diagnóstico [29].
Es esencial considerar que una prueba serológica positiva no siempre
indica la presencia del patógeno que provoca la enfermedad, sino que
señala únicamente que el animal ha pasado por una infección. Esta
diferencia resalta en comparación con las pruebas moleculares, donde
un resultado positivo denota la presencia activa de la infección [30].
Varias investigaciones han demostrado que la producción de
anticuerpos contra E. canis surgen aproximadamente entre los días
17 y 35 posteriores a la infección [31]. Por lo que un análisis serológico
puede diagnosticar falsos positivos dependiendo del tiempo post
infección, o retraso entre la infección y la detección de anticuerpos
[32]. Una ventaja adicional del diagnóstico molecular es la habilidad
para identicar los agentes incluso durante las primeras etapas de
la enfermedad y en la fase subclínica. Esto posibilita la detección
de animales portadores, incluso antes de que se desarrolle una
Ehrlichiosis Monocítica canina en la ciudad de Machala, Ecuador / Correa-Vivanco y cols._________________________________________
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respuesta inmune, permitiendo así iniciar el tratamiento antes de
que se maniesten signos clínicos [33].
En un contexto clínico, se sugiere que tras la aparición de los primeros
indicios de EMC la utilización conjunta de pruebas serológicas y de PCR
podría incrementar la probabilidad de obtener un diagnóstico preciso
ya que no existe una prueba oro para el diagnóstico de patógenos
transmitidos por R. sanguineus [32]. Estos hallazgos evidenciaron
una disparidad en la concordancia entre las pruebas serológicas y
los resultados de la PCR en la detección de E. Canis. Esto apunta a la
posibilidad de obtener resultados falsos positivos o falsos negativos
al depender exclusivamente de una única prueba.
Las irregularidades en los resultados de laboratorio son habituales
en las infecciones provocadas por hemoparásitos; sin embargo, su
presentación es muy diversa y carece de especicidad [34]. Las
principales alteraciones hematológicas signicativas encontradas en
el diagnostico serológico y molecular son anemia y trombocitopenia.
Resultados congruentes a los encontrados en un estudio molecular
de E. canis en India [35]. En este estudio las alteraciones de la serie
blanca no fueron signicativas, tanto para caninos positivos a la
prueba molecular como serológica, estos hallazgos son compatibles
a los encontrados por otra investigación [36]. Una posible explicación
para que muchos de los perros positivos no hayan mostrado
alteraciones en la serie blanca es que estos animales podrían haber
estado en la fase subclínica de la enfermedad, donde la mayoría son
asintomáticos y no presentan cambios hematológicos notables [37].
E. canis es reconocido como un patógeno exclusivo de los
caninos; no obstante, existen informes que indican la posibilidad
de transmisión zoonótica a seres humanos [20, 21]. Es crucial llevar
a cabo análisis de rutina para diagnosticar la EMC en mascotas. Por
lo tanto, realizar pruebas en perros para identicar estos patógenos
es esencial para respaldar el cuidado de la salud de la población
canina y, además, posibilita que los perros desempeñen un papel
como centinelas de la salud humana [38]. El desarrollo de una técnica
molecular para el diagnóstico de E. canis seria también aplicable en
muestras sanguíneas de humanos.
CONCLUSIONES
Los resultados, basados en pruebas de PCR, revelan una tasa
de positividad del 52 % en pacientes positivos a test ICA, lo que
demuestra una disparidad entre las pruebas serológicas y de PCR
lo que resalta la importancia de la combinación de ambos métodos
para obtener un diagnóstico preciso en un contexto clínico. Se
enfatiza que una prueba serológica positiva no garantiza la presencia
activa del patógeno, en contraste con las pruebas moleculares. La
producción de anticuerpos puede llevar a falsos positivos, subrayando
la importancia de considerar el tiempo post infección.
Conicto de intereses
Los autores declaran no tener conicto de intereses.
Rol de los autores
SYVC: Análisis Formal, Investigación, Metodología, Redacción–
revisión y edición. AEGL, LECT, RGSP, MNT: Análisis Formal,
Investigación, Redacción–revisión y edición.
Los autores declaran que no violaron u omitieron normas éticas o
legales en esta investigación.
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