https://doi.org/10.52973/rcfcv-e34387
Recibido: 05/02/2024 Aceptado: 08/04/2024 Publicado: 14/07/2024
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Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIV, rcfcv-e34387
Relación entre la hormona Anti–mülleriana y la respuesta superovulatoria
en vacas Holstein mestizas lecheras, criadas a pastoreo en el trópico alto
latinoamericano
Relationship between Anti–müllerian hormone and superovulatory response in dairy crossbreed
Holstein cows managed on grazing in the Latin American high tropics
Andrés Santiago Jácome–Aucay
1
, Juan José Zambrano–Villacis
1
, Luis Ayala–Guanga
2
*
1
Universidad Técnica de Manabí, Facultad de Ciencias Veterinarias. Portoviejo, Ecuador.
2
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Carrera de Medicina Veterinaria. Cuenca, Ecuador.
*Autor para correspondencia: luis.ayala@ucuenca.edu.ec
RESUMEN
La superovulación (SOV) ha permitido multiplicar los animales de alto
valor genético; sin embargo, la media de embriones transferibles
obtenidos no ha mejorado en los últimos años. Uno de los factores
que inuye fuertemente es la variabilidad individual de la donadora
respecto al número de folículos antrales presentes al momento del
inicio del protocolo de SOV. Por lo tanto, en el estudio se determinó
la relación y asociación existente entre la hormona Anti–mülleriana
(AMH) y el recuento de folículos antrales (RFA) al inicio del protocolo de
superovulación (T0), así como al momento de la primera inseminación
(T9). Además, se evaluó el proceso de ovulación mediante el conteo
de cuerpos lúteos (CL) presentes el día del lavado (CL16) y la cantidad
de estructuras y embriones transferibles colectados (día 16) en 36
vacas Holstein mestizas lactantes, manejadas en explotaciones
del trópico alto, en sistemas extensivos, alimentadas a pastoreo.
Se determinó una concentración media de 0,07 ± 0,03 ng·mL
-1
de
AMH, un RFA mayor a 4 mm promedio en día cero (T0) de 14,7 ± 4,30
folículos, con una relación y asociación entre estas variables baja
(r=0,21; R
2
=0,04; P>0,05); En contraposición, en día 9 (T9) el RFA fue
de 16,4 ± 5,2 folículos y la relación y asociación alta y signicativa
con la AMH (r=0,84; R
2
=0,70; P<0,05). Se estableció que el 22,2 %
animales con alta AMH, presentaron 2,6 veces más hormona, 1,8 más
folículos y proporcionaron 2,5 más embriones transferibles que las
donadoras de baja AMH (47,2 %). En conclusión, las donadoras con un
valor mayor a 0,09 ng·mL
-1
de AMH permiten mejorar los resultados
en biotécnicas reproductivas como MOET.
Palabras claves: Hormona Anti–Mülleriana; recuento de folículos
antrales; superovulación; Holstein
ABSTRACT
Superovulation (SOV) has permitted to multiply animals of high genetic
value; however, the average number of transferable embryos obtained
has not improved in recent years. One of the factors that strongly
inuences is the individual variability of the donor with respect to
the number of antral follicles present at the time of initiation of the
SOV protocol. Therefore, the study determined the relationship and
association between Anti–Müllerian hormone (AMH) and antral follicle
count (RFA) at the beginning of the superovulation protocol (T0), as
well as at the time of the rst insemination (T9). In addition, the
ovulation process was evaluated by counting the corpora lutea (CL)
present on the day of washing (CL16) and the amount of structures
and transferable embryos collected (day 16) in 36 lactating crossbreed
Holstein cows, managed in farms from the high tropics, in extensive
systems and fed to grazing. A mean concentration of 0.07 ± 0.03ng·mL
-1
of AMH was determined, an average RFA greater than 4 mm on day
0 (T0) of 14.7 ± 4.30 follicles, with a low relationship and association
between these variables (r=0.21; R
2
=0.04; P>0.05). In contrast, on
day 9 (T9) the RFA was 16.4 ± 5.2 follicles and the relationship and
association high and signicant with AMH (r=0.84; R
2
=0.70; P<0.05).
It was established that 22.2 % of the animals with high AMH presented
2.6 times more hormone, 1.8 more follicles and provided 2.5 more
transferable embryos than the low AMH donors (47.2 %). In conclusion,
donors with a value greater than 0.09 ng·mL
-1
of AMH allow to improve
the results in reproductive biotechnologies such as MOET.
Key words: Anti–Müllerian hormone; antral follicle count;
superovulation; Holstein
FIGURA 1. Protocolo de valoración de la concentración de hormona Anti–
mülleriana, recuento de folículos antrales en los días 0 (T0), y día 9 (T9) del
protocolo de SOV; así como la valoración de la cantidad de cuerpos lúteos (CL16),
estructuras y embriones obtenidos el día del lavado (día 16) en vacas Holstein
mestizas lecheras, criadas a pastoreo en el trópico alto latinoamericano.
MS=toma de muestra de sangre. RFA (T0)=recuento de folículos antrales
>4mm. RFA (T9)=recuento de folículos antrales >8mm el día de la primera IA.
CL=recuento de cuerpos lúteos presentes el día de 16. EST= número total de
estructuras colectadas (ovocitos no fecundados, embriones viables, embriones
degenerados o muertos). EMB=número de embriones transferibles colectados.
M=mañana y T= Tarde de los días del protocolo de superovulación (SOV)
Relación entre AMH y SOV en vacas Holstein Mestizas / Jácome-Aucay y cols._____________________________________________________
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INTRODUCCIÓN
La multiovulación y transferencia de embriones (MOET) es una
técnica de reproducción asistida en bovinos utilizada desde la
década de 1970 [1]. En el año 2021 se llegó a producir alrededor de
386 mil embriones transferibles in vivo a nivel mundial [2]. Si bien
esta biotecnología ha permitido aumentar el número de animales
genéticamente superiores, no es menos cierto que en los últimos
40 años los resultados no han mejorado [3]. La baja respuesta en
los protocolos de superovulación (SOV) está relacionada a factores
inherentes al animal [4, 5], que han sido estudiados a profundidad
como la raza [6], estado nutricional [7], momento del ciclo estral
[8], paridad [9], edad [10], o aquellos factores externos como el tipo
de hormona [4], dosis de hormonas [11], duración del tratamiento
[12] y factores medioambientales [13]. Sin embargo, todos los
conocimientos generados no han permitido mejorar los resultados
en las proporciones esperadas.
Autores como Ireland y col. [14], mencionaron que un factor a
profundizar es la alta variabilidad individual de las donadoras a
los tratamientos de SOV, ya que la cantidad de folículos antrales
disponibles al momento de iniciar los protocolos tienen efecto directo
sobre la calidad y cantidad de embriones producidos. Por lo tanto,
identicar hembras con alto recuento de folículos antrales (RFA)
podría mejorar los resultados obtenidos hasta ahora en la SOV, ya que
el RFA individual es repetible (r=0,85; [15]) y heredable (0,31 ± 0,14) en
un mismo animal [16].
En la actualidad la ecografía transrectal es la técnica utiliza para
identicar y seleccionar donadoras con alto RFA [17, 18]. Sin embargo,
esta técnica requiere personal capacitado, equipos costosos e
instalaciones adecuadas [19], además, es necesario realizar varios
escaneos ecográcos durante el ciclo estral de la donadora para
determinar con exactitud el RFA [20].
Una alternativa que ha generado gran expectativa es la
cuanticación de la hormona Anti–mülleriana (AMH). Esta es una
glicoproteína de 140 kDa que pertenece a la familia del factor de
crecimiento transformante β (TGFβ), producida por las células
de la granulosa de folículos pequeños en crecimiento [21]. Se ha
relacionado la concentración de esta hormona con el RFA; las vacas
con altos RFA tienen concentraciones de AMH considerablemente
mayores que las de bajo RFA [22]. Además, las vacas con bajo
RFA tienen una respuesta superovulatoria pobre [23], menor
concentración de P
4
y grosor del endometrio entre los días cero y
seis del ciclo estral que las vacas con alto RFA [24]. Esta relación
entre las concentraciones de AMH y el RFA se ha identicado tanto
en vacas Bos indicus [25], como en Bos taurus criadas en el trópico
bajo condiciones de producción intensiva [26]. Asimismo, en varios
estudios se ha indicado que las concentraciones de AMH pueden
utilizarse como biomarcador endócrino para predecir la respuesta
ovulatoria en vacas de aptitud lechera [27], en vaquillas criadas en
países de cuatro estaciones [28], en el trópico bajo en condiciones
climáticas húmedas [15] y secas [29].
Sin embargo, hasta ahora no hay información disponible en ganado
vacuno de genotipo Holstein mestizo, criadas en el trópico alto en
sistemas extensivos, alimentadas al pastoreo. Considerando que el
sistema de crianza, las características medioambientales propias de
la zona geográca y la adaptabilidad que han logrado los animales en
este medio han generado cambios en algunos aspectos de la siología
ovárica [30, 31, 32]. Por lo tanto, es importante indagar si la relación
entre el RFA y la concentración de AMH descrita anteriormente en
otros genotipos y medioambientes también ocurre en vacas del
trópico alto latinoamericano bajos condiciones de producción
extensiva.
Con estos antecedentes el estudio buscó determinar la relación
entre la concentración plasmática de AMH, y la respuesta
superovulatoria en donadoras Holstein mestizas lactantes,
alimentadas al pastoreo en explotaciones extensivas del trópico
alto latinoamericano.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales y granja
La investigación se realizó en 15 ganaderías comerciales, ubicadas
en el trópico alto del Ecuador, sobre los 2.500 metros sobre el nivel
del mar, situadas en ecosistemas con temperaturas ambientales
entre 7 a 18°C, humedad relativa 80 %, pluviosidad anual de 800 mm
a 2.000 mm. Las ganaderías poseían un sistema de manejo extensivo
controlado, alimentación con una mezcla de gramíneas (Pennisetum
clandestinum), y leguminosas (Lolium multiorum), (Trifolium pratense),
(Trifolium repens), concentrado comercial y sales minerales.
Se seleccionaron 44 vacas de genotipo Holstein (Bos taurus) mestizo
de carácter lechero (cruce entre Holstein y Criollo), peso promedio
de 553,8 ± 12,8 kg, condición corporal (CC) de 3,2 ± 0,05, escala de
1–5, según lo descrito por Song y col. [33], edad media de 5,9 ± 0,22
años, multíparas (3,1 ± 0,18 partos), producción láctea promedio
de 19,1 ± 0,80 litros, cíclicas, sin problemas reproductivos, con un
mínimo de 60 días de post parto. Se descartaron del experimento 8
donadoras por presentar problemas pódales y mastitis subclínica.
Durante la realización del estudio se tuvo presente la normativa del
código sanitario para animales terrestres, capítulo 7.8 “Utilización de
animales en la investigación y educación”, de la Organización Mundial
de Sanidad Animal [34].
Diseño experimental
El experimento fue dividido en dos etapas, en la primera se
determinó la relación y asociación entre la hormona AMH y el RFA,
al inicio del protocolo de superovulación (T0), así como con el RFA
observado previo a la primera inseminación (T9); además, se evaluó
la ovulación mediante el conteo de cuerpos lúteos el día de la colecta
(CL16), la cantidad de estructuras (ovocitos no fecundados, embriones
viables, embriones degenerados o muertos), y embriones transferibles
FIGURA 2. Protocolo de superovulación en vacas Holstein mestizas. BE=benzoato
de estradiol. P4=Progesterona inyectable. DIV=dispositivo intravaginal
de progesterona. FSH=hormona folículo estimulante. PG=prostaglandina.
IA=inseminación. GnRH=gonadorelina. Colecta=colecta de embriones
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recuperados (día 16). En esta parte del experimento se realizó la
valoración de las 36 donadoras en conjunto (FIG. 1).
En una segunda etapa las 36 donadoras fueron agrupadas en animales
con alta (G1: n=8), media (G2: n=11) y baja (G 3: n=17) concentración de
AMH, para lo cual se siguió la metodología descrita por Rico y col.
[27], en la que brevemente se indica que se debe realizar terciles para
separar los grupos. Se analizó el efecto de esta clasicación (G1, G2 y
G3) sobre el RFA en los días cero (T0) y nueve (T9), el número de cuerpos
lúteos el día del lavado uterino (día 16 del protocolo SOV), y el número
de estructuras y embriones obtenidos luego del mismo.
Determinación de la concentración plasmática de la Hormona Anti–
mülleriana (AMH)
En la mañana del día cero (T0) se colectó una muestra de sangre
en tubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Vacutainer
®
),
mediante punción de la vena coccígea. Las muestras fueron colocadas
en un termo transportador con gel refrigerante a 5°C y llevadas al
laboratorio, donde fueron centrifugadas (Micro 200, Hettich, Alemania)
a 3.000 g × 20 min. El plasma obtenido se retiró y almacenó en alícuotas
en tubos eppendorf (Joanlab, Zhejiang, China) a -20°C (Congelador
RI405CR, INDURAMA, Ecuador), hasta el posterior análisis de AMH.
La concentración plasmática de AMH fue determinada con el kit
ELISA tipo sándwich, (kit DL–AMH–b, Develop®, China), siguiendo
las instrucciones del fabricante. Brevemente, la prueba se basó en
la intensidad del color mediante espectrofotometría (BioTek 800
TS, Agilent, Santa Clara–CA, USA) a una longitud de onda de 450
nm. De acuerdo al fabricante el kit tiene una sensibilidad inferior a
0,117ng·mL
-1
; los coecientes de variación inter e intra ensayo fueron
menos de 10 y menos de 12 %, respectivamente.
Recuento de folículos antrales (RFA)
Para determinar el número de folículos antrales (RFA), los ovarios
fueron escaneados transrectalmente por un mismo técnico, como lo
describió Ayala y col. [32], con un ecógrafo (ProSound 2, Aloka, Tokyo,
Japón) provisto de un transductor lineal de 7,5 MHz. Las evaluaciones
ecográcas para determinar el RFA se realizaron el día cero (día
desconocido del ciclo estral de las donadoras–T0), y el día nueve del
protocolo (T9), día de evaluación de la respuesta SOV, inmediatamente
antes de la inseminación articial (FIG. 1).
Superovulación, colección y evaluación de embriones
Las vacas fueron superovuladas usando un protocolo estándar
con 8 dosis decrecientes de FSH (FIG. 2). Brevemente, todas las
donadoras recibieron el día 0 un dispositivo intravaginal de liberación
de progesterona DIV (CIDR
®
; 1,38 g de progesterona; Zoetis, Quito,
Ecuador) + 2 mg de benzoato de estradiol (BE; Gonadiol
®
; Zoetis,
Quito, Ecuador), por vía intramuscular (IM), y 50 mg de progesterona
inyectable (Progesterona
®
; ERMA, Quito, Ecuador). A partir del día
4 en la tarde las donadoras recibieron dosis decrecientes de FSH
(Folltropin–V
®
, Vetoquinol, Québec, Canada) cada 12 horas de la forma
siguiente: 60, 60, 40, 40, 30, 30, 20, 20 mg, tal como se indica en la
FIGURA 2. El día 6 en la tarde y 7 en la mañana se aplicaron 25 mg
de Dinoprost Trometamina (Lutalyse
®
, Zoetis, Lima, Perú). El día
8 se detectó el celo por observación directa y mediante parches
indicadores de estro (Estrotect
TM
, Rockway Inc., Spring Valley, USA).
En la mañana del día 9 se realizó una inseminación articial (IA) y se
inyectó una dosis de 0,25 mg de Gonadorelina (GnRH
®
, MSD, Nueva
York, USA) y 12 h después se practicó la segunda IA.
Valoración del número de cuerpos lúteos (CL
16
)
Para valorar la respuesta superovulatoria, se cuanticó el número de
cuerpos lúteos presentes en los ovarios en el día 16, luego del lavado de
las donadoras, mediante ultrasonografía como se describió en el RFA.
Colecta de embriones
Siete días después de la primera inseminación artificial, las
donadoras fueron colocadas en una manga, teniendo presente las
normas de bioseguridad tanto para el operador como para el animal.
Se realizó asepsia del área vulvar y perineal. Para la insensibilización y
tranquilización, se utilizó una mezcla de 4 mL de Clorhidrato de lidocaína
al 2 %, (Lidocaine
TM
, Richmond Vet Pharma, Buenos Aires, Argentina)
y 0,4 mL de Xilacina al 2 % (Xilacina20, Richmond Vet Pharma, Buenos
Aires, Argentina), vía epidural. Los embriones fueron colectados
mediante técnica no quirúrgica, con un sistema de circuito abierto
con ujo continuo (Tubo de 2 vías, Minitube USA, Verona, USA). Para el
lavado se utilizó medio de lavado comercial (ViGRO™, Vetoquinol, Québec,
Canada) y los embriones fueron colectados en un ltro EmCon de 75
µm, (Minitube USA, Verona, USA). El grado de desarrollo y calidad de los
embriones fue determinada en base a los parámetros establecidos por
la Sociedad Internacional de Tecnología Embrionaria [35].
Análisis Estadístico
Las variables continuas concentración de hormona Anti–
mülleriana, número folículos en los días cero y nueve, tamaño de
folículo ovulatorio, número de cuerpos lúteos en el día 16, tamaño
del cuerpo lúteo, total de estructuras (ovocitos no fecundados,
embriones transferibles, embriones degenerados o muertos) y número
de embriones transferibles fueron procesadas para vericar si se
ajustaban a los criterios de distribución normal y de homogeneidad.
Las variables que no cumplieron estos criterios fueron transformadas
a logaritmo 10. Los datos se analizaron con el procedimiento GLM de
SAS; y las diferencias entre medias se compararon con el método
de los mínimos cuadrados del SAS. Se consideró signicativo un
valor de P<0,05. La relación y asociación entre la concentración
de hormona Anti–mülleriana y el recuento de folículos antrales
fueron analizadas mediante las pruebas de correlación de Pearson
y regresión simple del programa estadístico Statical Analysis System
(SAS) respectivamente [36].
TABLA I
Media y desviación estándar de la concentración plasmática de hormona
Anti–mülleriana (AMH), del RFA realizado los días cero (T0) y 9 (T9) del
protocolo de superovulación y del número total de cuerpos lúteos,
estructuras y embriones transferibles colectados en el día 16 (T16)
Variable
µ ± DE
(n=36)
Valores Correlación *
Mín Máx R P
1. Hormona Anti–mülleriana (AMH) 0,07 ± 0,03 0,03 0,15 ̶ ̶
2. Recuento de folículos antrales T
0
14,7 ± 4,3 8,00 26,0 0,21 0,23
3. Recuento de folículos antrales T
9
16,4 ± 5,2 7,00 27,0 0,84 0,01
4. Recuento de CL
16
10,8 ± 3,6 5,00 18,0 0,73 0,01
5. Estructuras colectadas
16
7,5 ± 3,2 0,00 14,0 0,76 0,01
6. Embriones transferibles
16
4,2 ± 2,8 0,00 11,0 0,78 0,01
Los datos se expresan como valores medios ± desviación estándar (D.E). *: correlación
entre la concentración de AMH (1) con cada una de las otras variables (2–6)
Relación entre AMH y SOV en vacas Holstein Mestizas / Jácome-Aucay y cols._____________________________________________________
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis general de la concentración de la hormona Anti–mülleriana,
recuento de folículos antrales, y relación y asociación entre las
dos variables
La concentración media de la AMH (n=36) fue 0,07 ± 0,03 ng·mL
-1
,
con un valor mínimo de 0,03 ng·mL
-1
y un máximo de 0,15 ng·mL
-1
(TABLAI). Estos resultados presentaron alta variabilidad con respecto
a los reportados previamente por Rico y col. [37] para la raza Holstein,
en condiciones de manejo y medioambientales diferentes (vacas de
4–9 años de edad, en el trópico bajo). Estos autores describieron una
concentración mínima de 0,025 ng·mL
-1
(similar al presente estudio),
sin embargo, el valor máximo (0,228 ng·mL
-1
) fue 1,5 veces mayor que
en el presente estudio.
Al realizar el recuento de folículos antrales (RFA) mayores a 4 mm el
día de inicio del protocolo de superovulación (T0), se observó un valor
mínimo de 8 y máximo de 26 folículos, con una media de 14,7 ± 4,30
folículos. De igual manera, al evaluar la respuesta al proceso de
superovulación, mediante el RFA mayor a 8 mm el día 9 del protocolo
(T9), se obtuvo una media de 16,4 ± 5,2 (rango 7–27 folículos).
Los resultados del RFA obtenidos los días cero y 9 en el presente
trabajo está en concordancia con los valores establecidos para vacas
de raza Holstein (18,5 ± 9,0 folículos), alimentadas al pastoreo, en zonas
altas de Irlanda [41], que son criadas en condiciones de alimentación
y medioambientales similares a las de este trabajo.
Sin embargo, cuando se evaluó el genotipo Holstein, bajo sistemas
de alimentación intensivo (ración totalmente mezclada), en el
trópico bajo, se estableció una media de 26 ± 1 folículos [38], valor
similar (27,2 ± 12,2 folículos) al descrito por Furukawa y col. [42] en
condiciones equivalentes. Los resultados de estas dos investigaciones
presentaron en promedio 1,8 veces más folículos antrales que en el
presente estudio. Un factor que puede haber inuido en la presencia
de menor número de folículos en este tipo de animales (Holstein
mestizos) es el sistema de alimentación (pastoreo), caracterizado
por un valor energético reducido de los pastos [30]. De hecho,
estudios de epigenética (reprogramación) describen que terneras
nacidas de madres con restricción nutricional (60 % del requerimiento
nutricional, en los primeros 110 días de gestación) presentaron un
RFA (15,8 ± 1,8 folículos) y concentraciones de AMH menores que la
descendencia de madres que consumieron el 120 % del requerimiento
nutricional (RFA= 23,6 ± 1,9) [43]. También se ha descrito que una
nutrición deciente de las madres impacta negativamente sobre el
RFA y los niveles de AMH en su descendencia [44].
Además, en un estudio realizado en ovinos criados a gran altitud,
ven reducida su población folicular a consecuencia de un efecto
adverso de hipoxia hipobárica sobre la función del eje hipotálamo–
hipósis–ovarios. Esto provoca problemas en la esteroidogénesis por
disminución de la secreción de FSH y LH, lo cual a su vez inuye en
el número y crecimiento de los folículos disponibles [45]. Un efecto
semejante se ha determinado también en la mujer [46]. Sin embargo,
en la especie bovina no se ha encontrado información sobre el efecto
especíco de la hipoxia hipobárica sobre la fertilidad; no obstante,
en estudios previos se describieron cambios en algunos aspectos
de la siología ovárica del bovino Criollo en la sierra del Ecuador,
incluyendo un menor número de folículos antrales, precisamente en
una región semejante a la de este estudio [32] y que podrían estar
relacionado al factor altura.
La relación entre la concentración de AMH y el RFA en el día de
inicio del protocolo de SOV fue baja (r=0,21; P>0,23) y no signicativa
(TABLAI); además, se estableció una asociación lineal baja (R
2
=0,04;
P>0,05) y no significativa (FIG. 3A). Al contrario, al relacionar el
recuento de folículos antrales >8 mm realizado el día 9 del protocolo,
con la concentración de la AMH, se determinó una relación alta y
signicativa (r=0,84; P<0,01) y una asociación fuerte (FIG. 3B) entre
estas dos variables (R
2
=0,70; P<0,05).
Los resultados obtenidos en el día de la valoración de la respuesta
SOV (día conocido del ciclo estral) permitieron corroborar la fuerte
relación entre la AMH y el RFA previamente establecida en la raza
Holstein por varios investigadores. Así [15, 31, 37], describieron
correlaciones de r=0,59 (P<0,001); r=0,66; P<0,001 y r=0,80; P<0,001
respectivamente, en vacas estabuladas con alimentación controlada
en el trópico bajo.
Esta diferencia en el valor máximo de la AMH se acentúa aún más en
el estudio realizado en vacas Holstein estabuladas en el trópico bajo,
con un valor mínimo de 0,038 (similar a los valores de este trabajo)
y un máximo de 0,774 ng·mL
-1
, que representa 5,2 veces más que el
obtenido en este estudio (0,15 ng·mL
-1
) [38]. Por otra parte, el valor
máximo de AMH para vacas de leche negras japonesas (1,99 ng·mL
-1
)
fue 13,3 veces más alta [39] que en esta investigación. Además, fue
2,6 veces mayor que lo reportado por Gobikrushan y col. [38] y 8,7
veces más alta que lo descrito por Rico y col. [37], sin embargo, el
valor mínimo de AMH (0,032 ng·mL
-1
) fue semejante a los resultados
obtenidos en los tres estudios anteriormente citados.
La variabilidad en los valores de AMH está probablemente relacionada
con la utilización de diferentes métodos analíticos. Así, Rico y col.
[37], utilizaron el kit DSL (Cergy–Pontoise, Francia) testado para
líquido folicular bovino. Hirayama y col. [39] utilizaron el kit Gen II
Elisa (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) y Gobikrushanth y col. [38], el
kit Ansh Labs Bovine AMH Elisa (Webster, TX, USA). Si bien todos los
kits indicados fueron previamente testados para su uso en bovinos,
la evidencia demuestra que los análisis con distintos kits pueden dar
lugar a resultados diferentes. En un estudio se demostró que si bien
los resultados pueden estar altamente correlacionados linealmente
entre sí (r=0,84; P<0,0001), los valores medios de AMH obtenidos con
un kit pueden llegar a ser 4,6 veces menores según el kit utilizado [40].
3A
3B
4A
4B
FIGURA 3. Asociación entre el nivel de hormona Anti–mülleriana y el recuento
de folículos antrales en el día 0 (3A) y 9 (3B) del protocolo de superovulación.
FIGURA 4. Asociación entre el nivel de hormona Anti–mülleriana y el número
de embriones transferibles (4A) y de estructuras recuperadas (B) el día 16
del protocolo de superovulación
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En lo que respecta a la asociación lineal observada en el día cero del
protocolo de SOV (día desconocido del ciclo estral), concuerda con los
datos descritos por Gobikrushanth y col. [38] quienes determinaron
una asociación lineal baja en un momento desconocido del ciclo
estral (R
2
=0,29).
Basado en el número de cuerpos lúteos en el día 16 y de folículos
mayores a 8 mm en el día 9 del protocolo SOV se determinó una
tasa de ovulación de 65,9 %, que tuvo una correlación positiva alta y
signicativa (r=0,73; P<0,01) con la AMH (TABLA I).
Al evaluar las estructuras colectadas se determinó una media de
embriones transferibles de 4,2 ± 2,8 / lavado. Si bien este valor se
encuentra por debajo de lo descrito a nivel internacional [47], cuyo
valor promedio de 6,4 embriones transferibles/lavado. Es importante
enfatizar que se hace referencia a promedios comerciales con donadoras
seleccionadas minuciosamente, lo que no sucedió en el presente trabajo
ya que por la naturaleza del estudio se superovularon vacas con alto y
bajo RFA. Este argumento es corroborado por un estudio realizado, en
el cual valoran la relación de la AMH y la respuesta a la SOV en vacas Bos
taurus (Simental) y obtuvieron un promedio de embriones trasferibles de
3,21, valor inferior al obtenido en la presente investigación [48].
La correlación entre el número de estructuras obtenidas y la
concentración de AMH fue alta (r=0,78; P<0,01) y considerablemente
mayor a la descrita por Rico y col. [27], de r=0,46, P<0,01 para vacas
Holstein. Asimismo, la prueba de regresión lineal entre las dos
variables mostró un grado de asociación de R
2
=0,61; P<0,01 (FIG. 4).
Resultados según los grupos de alta, intermedia y baja concentración
de hormona Anti–mülleriana
Luego de categorizar las donadoras por la concentración de AHM, se
estableció que el 22,2 % (n=8) fueron animales con altos niveles de AMH,
el 30,6 % tuvieron concentración media (n=11) y el 47,2 % concentración
baja (n=17). Las vacas con niveles altos de AMH (0,13 ± 0,02 ng·mL
-1
)
presentaron una concentración de hormona 2,6 veces mayor que las
vacas con baja AHM (0,05 ± 0,01 ng·mL
-1
; P<0.05; FIG. 5A).
FIGURA 5. Panel A: Puntos de corte de la hormona Anti–mülleriana en el día 0
del protocolo de superovulación en donadoras Holstein mestizas. Grupo de baja
(n=17) media (n=11) y alta (n=8) concentración de la hormona. Panel B: Recuento
de folículos antrales en el día 9 del protocolo de superovulación. *: P<0,05
FIGURA 6. Número promedio de cuerpos lúteos (Panel A) y total de
estructuras colectadas (Panel B), en donadoras Holstein mestizas de acuerdo
al nivel de la hormona Anti–mülleriana (bajo, medio y alto). *: P<0,05
Relación entre AMH y SOV en vacas Holstein Mestizas / Jácome-Aucay y cols._____________________________________________________
6 de 9
Además, el número de folículos antrales observados a día 9 del
protocol de SOV, en el grupo de alta concentración de AMH fue casi el
doble (23,1 ± 1,28 folículos) con relación al grupo de bajo nivel de AMH
(13,1 ± 0,76 folículos; P<0,05). Sin embargo, al inicio del protocolo (T0),
el número promedio de folículos antrales en los tres grupos fue similar
(bajo=14,6 ± 1,11; medio=15,2 ± 1,22; alto=14,1 ± 1,87 folículos; P>0,05; FIG. 5B).
Respuesta al protocolo de superovulación en los grupos de alta,
media y baja concentración de AMH
El porcentaje de ovulación en el grupo alta y baja AMH fue de 57,6 y 74,8
% respectivamente, valores semejantes (66,7 %) al de otros estudios en
ganado Holstein [50]. Este porcentaje de ovulación se determinó en base
al número de CLs observados mediante ecografía el día 16 del protocolo,
llegando a establecer que el grupo de alta concentración de AMH presentó
un 26,3 % más de cuerpos lúteos (13,3 ± 0,97), en comparación con el grupo
de baja AMH (9,8 ± 0,57CL; FIG. 6A). Este mayor porcentaje de ovulación
en vacas con alta concentración de AMH, también fue descrita al valorar
vacas Holstein en sistemas intensivos [26]; sin embargo, los valores
medios dieren de los resultados reportados en esta investigación
(25,6 ± 2,5; Alta y 12,0 ± 15; baja AMH). En bovinos de carne los resultados
descritos son similares con valores más altos de CLs en donadoras con
alta AMH (17,6 CL) vs 8,5 CLs en vacas de baja AMH [23].
Al valorar el porcentaje de recuperación de estructuras se
determinó que el grupo de alta concentración de AMH se recuperó
un 84,2 % de estructuras, con una media de 11,2±0,77 estructuras,
vs un 67,3 % en el grupo de baja AMH (media 6,6±0,46; FIG. 6B). Este
resultado permite armar que superovular vacas con altos niveles
El RFA en el grupo de menor concentración de AMH fue similar
(11,9 ± 1,2 folículos) en animales Holstein con similares características de
paridad [22], aunque en el grupo de alta concentración describieron un
41,7 % más de folículos antrales (39,61 ± 2,3 folículos) que los observados
en este estudio. Esta variabilidad también se observó en animales
Holstein más jóvenes (0,57 ± 0,26 ng·mL
-1
y 34,3 ± 3,12 folículos versus
0,06 ± 0,02 ng·mL
-1
y 13,4 ± 1,40 folículos en grupos de alta y baja
AHM, respectivamente [15]. Es probable que el menor RFA y nivel de
AHM observado en los animales del grupo de AMH alta pueda estar
relacionado con el sistema de alimentación al pastoreo que predomina
en las ganaderías ubicadas en la sierra alta ecuatoriana [49], sumado al
efecto negativo que la hipoxia hipobárica presente en estas altitudes.
FIGURA 7. Media de embriones transferibles (Panel A) y ovocitos no
fecundados colectados (Panel B), en donadoras Holstein mestizas de
acuerdo al nivel de la hormona Anti–mülleriana (bajo, medio y alto)
_____________________________________________________________________________Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIV, rcfcv-e34387
7 de 9
de AMH permite recuperar 16,9 puntos porcentuales más estructuras
que el grupo de baja AMH, datos similares fueron descritos para
vacas Holstein (14,0 ± 2,35; alta y 5,0 ± 1,2 estructuras; baja AMH; [51].
Finalmente, al evaluar el total de estructuras que fueron colectadas
en cada grupo experimental, se estableció que en los de alta
concentración de AMH un 73,2 % fueron embriones transferibles
(promedio 8,2 ± 0,77 embriones/vaca; FIG. 7A); sin embargo, en el grupo
de baja AMH se obtuvo 5 embriones transferibles menos (promedio
3,2 ± 0,50 embriones/vaca; FIG. 7A). Esta relación entre grupos de alta
y baja AMH fue observada en otros estudios, quienes establecieron
3,1 ± 0,8 y 7,2 ± 1,4 embriones/vaca respectivamente [26], en la raza
Holstein en condiciones de manejo diferentes, para ganado lechero
con valores de 11,1 ± 1,7 (grupo de alta) y 4,4 ± 0,9 embriones transferibles
(grupo de baja concentración de AMH) [29]. Por otro lado, el número
de ovocitos no fecundados dirió entre los grupos de alta, media baja
concentración de AMH en donadoras (FIG. 7B). Por lo tanto, superovular
animales con alta concentración de AMH permite obtener 2,5 veces
más embriones transferibles que el grupo de baja AMH.
CONCLUSIONES
Se estableció una concentración de AMH de 0,09 ng·mL
-1
como valor
referencial para la selección de vacas donadoras con alta población
folicular. Este valor de corte permitió seleccionar el 22 % de las vacas
incluidas en el estudio, que tuvieron 1,8 veces más folículos antrales
y produjeron 2,5 veces más embriones transferibles que las de baja
concentración de AMH. Se observó una correlación y asociación
alta y signicativa entre la concentración de AMH y el RFA; así como
con el número de estructuras y embriones transferibles obtenidos.
Esta estrategia de utilizar la concentración de AMH para seleccionar
donadoras podría mejorar sustancialmente la producción de
embriones in vivo en vacas Holstein mestizas en sistemas extensivos
del trópico alto latinoamericano.
Conictos de interés
Los autores declaran que no existen conictos de intereses
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