https://doi.org/10.52973/rcfcv-e34339
Recibido: 16/10/2023 Aceptado: 13/02/2024 Publicado: 12/06/2024
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Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIV, rcfcv-e34339
RESUMEN
En este estudio, los archivos ab1 obtenidos de la secuenciación Sanger
(hacia adelante y hacia atrás) se utilizaron para realizar el ensamblaje y
análisis de la secuencia. Para ello se utilizó el software Staden Package
(versión 2.0b10), el cual consta de dos programas: Pregap4 y Gap4.
Pregap4 fue responsable del análisis de calidad y la preparación de
datos, mientras que Gap4 realizó el ensamblaje, la verificación, el
análisis de pares de lectura, la edición contig y el cálculo de conanza
de la secuencia de consenso. Se utilizó BLASTn para identificar
posibles homólogos (Babesia bovis y B. bigemina). La secuenciación
basada en secuencias del gen 18S de B. bigemina, utilizando los
oligonucleótidos PIRO A For: (5'–TACCCAATCCTGACACACAGGG–3') y
PIRO B (5'–TTAAATACACGAATGCCCCCCCAAC–3'), mostrando una banda
de aproximadamente 393 pb, reveló la distribución nucleótica de una cepa
designada como 4623Ba.bi_GIR–E, de B. bigemina. El producto produjo
una secuencia de 369 pb (>H230420–007_C05_46_Oligo1.ab1) y 371 pb
(>H230420–007_I07_46_Oligo2.ab1). B. bigemina fue aislada de sangre
periférica de ganado mestizo infectado, positivo a prueba de Giemsa,
PCR–RFLP y qRT–PCR, del municipio de Girón en la provincia del Azuay,
Ecuador, ubicado a más de 2.000 metros sobre el nivel del mar, el cual
comparte 99,72 % de homología con varias secuencias de B. bigemina
reportadas en Ecuador, países latinoamericanos como Colombia,
Brasil, revelando posibles orígenes del patógeno y, con las secuencias
de B. bigemina publicadas aisladas en latitudes extracontinentales,
corroborando así la estabilidad genómica del parásito.
Palabras clave: Babesia bigemina; Babesia bovis; Rhipicephalus
microplus; frotis de Giemsa; PCR–RFLP; qRT–PCR;
secuenciación de Sanger
ABSTRACT
In this study, the ab1 les obtained from Sanger sequencing (forward
and reverse) were used to perform sequence assembly and analysis.
For this, the Staden Package software (version 2.0b10) was used,
which consists of two programs: Pregap4 and Gap4. Pregap4 was
responsible for quality analysis and data preparation, while Gap4
performed assembly, verication, read pair analysis, contig editing,
and condence calculation of the consensus sequence. BLASTn was
used to identify possible homologs (Babesia bovis and B. bigemina).
Sequence–based sequencing of the 18S gene of B. bigemina, using
the oligonucleotides For: PIRO A (5'–TACCCAATCCTGACACACAGGG–3')
y PIRO B (5'–TTAAATACACGAATGCCCCCCCAAC–3'), which obtained a
band of approximately 393 bp, revealed the nucleotic distribution of
a strain designated as 4623Ba.bi_GIR–E, of B. bigemina. The product
yielded a sequence of 369 bp (>H230420–007_C05_46_Oligo1.ab1) and
371 bp (>H230420–007_I07_46_Oligo2.ab1). B. bigemina was isolated
from the peripheral blood of infected crossbred cattle, positive for
Giemsa smear, PCR–RFLP and qRT–PCR, from the Municipality of
Girón in the Province of Azuay, Ecuador, located at greather than
2,000 meters above sea level, which shares high homology, greather
than 98 %, with several sequences of B. bigemina reported in Ecuador,
Latin American Countries such as Colombia, Brazil, revealing possible
origins of the pathogen and, with the sequences of B. bigemina
published isolated in extra–continental latitudes, thus corroborating
the genomic stability of the parasite .
Key words: Babesia bigemina; Babesia bovis; Rhipicephalus microplus;
Giemsa smear; PCR–RFLP; qRT–PCR; Sanger sequencing
Reporte secuencia de una cepa de Babesia bigemina aislada en bovinos del
municipio Girón, Azuay, Ecuador
Sequence report of a strain of Babesia bigemina isolated in cattle from the Girón Municipality,
Azuay, Ecuador
Jorge Gualberto Bustamante–Ordóñez
1,3
*, Diego Andrés Bustamante–Guzmán
2
, Sergio Emiro Rivera–Pirela
3
1
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Cuenca, Ecuador.
2
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Químicas. Cuenca, Ecuador.
3
Universidad del Zulia, Facultad de Ciencias Veterinarias. Maracaibo, Venezuela.
*Correo para correspondencia: jorge.bustamante@ucuenca.edu.ec
Secuencia de la Babesia bigemina en el Ecuador / Bustamante-Ordóñez y cols.____________________________________________________
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INTRODUCCIÓN
Los protozoarios intraeritrocitarios Babesia bovis y B. bigemina son
los agentes causales de la Babesiosis bovina, que provoca importantes
pérdidas económicas a la ganadería en áreas enzoóticas. B. bovis y
B. bigemina, son eucariotas inferiores alveolados pertenecientes
al phylum Apicomplexa, la clase Aconoidasida, orden Piroplasmida
y familia Babesiidae. Entre las especies más importantes que
afectan al ganado bovino se encuentran B. bovis, B. bigemina y B.
divergens. Actualmente las especies que se encuentran ampliamente
distribuidas en África, Australia, América Central y del sur son B.
bovis y B. bigemina [1].
El vector responsable de la transmisión de la babesiosis bovina en
Latinoamérica y varias partes del mundo es la garrapata Rhipicephalus
(Boophilus) microplus . En Ecuador, los datos sobre la ecología de
las garrapatas y la información sobre su distribución son escasos.
Enríquez y col. [2], realizan una clasicación taxonómica de las
garrapatas que infestan al ganado bovino en la provincia de Loja;
zona geográca limítrofe con la provincia del Azuay en la que se
encuentra el municipio Girón, y concluyen que el 100 % de las
garrapatas encontradas pertenecen a R. microplus.
La presencia de B. bovis y B. bigemina en la sangre de los bovinos
puede ser detectada por observación al microscopio óptico de
extendidos nos de sangre periférica coloreados con la tinción de
May Grünwald–Giemsa [3] y por métodos moleculares cualitativos
analizando el polimorsmo de longitud de fragmentos de restricción
(PCR–RFLP) y PCR tiempo real cuantitativa (qRT–PCR). En estos
preparados de frotis sanguíneos, los eritrocitos infectados contienen
distintas formas del parásito, las formas simples ovaladas (merozoítos),
las formas de anillo (trofozoíto) y las formas pares (merozoítos luego
de la división celular). En el caso de B. bovis estos cuerpos ovalados
miden alrededor de 2,0 × 1,5 µm, mientras que B. bigemina mide 4,5 ×
2,0 µm. Es por esta razón que a B. bigemina se la incluye dentro de las
babesias “grandes” y a B. bovis dentro del grupo de las “pequeñas” [4].
Para la detección de Babesia por PCR convencional se utilizan
cebadores especícos: PIRO A (5'–TACCCAATCCTGACACACAGGG–'3) y
PIRO B (5'–TTAAATACACGAATGCCCCCCCAAC–3') [5]. Estos amplican
parcialmente el gen 18s rRNA de Babesia spp., mostrando una banda
de aproximadamente 400 pares de bases (pb) del ssu–rDNA de la
mayoría de especies de Babesia [6]. La capacidad de los cebadores
combinados PIRO–A y PIROB para discriminar especies de Babesia
permite distinguir B. bovis, B. bigemina y B. microti debido a que
los productos amplicados muestran un polimorsmo de tamaño
diferente de 390, 395 y 408 pb, respectivamente [6].
El gen ribosomal 18S rARN, denominado subunidad pequeña o SSU
(del inglés “small ribosomal subunit”), es ampliamente utilizado para
realizar estudios moleculares y logenéticos entre miembros del phylum
Apicomplexa, debido a que poseen regiones muy conservadas [7, 8,
9]. Su ritmo evolutivo es lento siendo un gen altamente conservado.
Tiene un alto nivel de sensibilidad, y reportes de identidad cercanos
al 100 % [10, 11, 12, 13]. B. bigemina tiene 3 copias del gen 18S rARN,
de acuerdo a lo demostrado por Román y col. (1991) [14], quienes las
denominaron a y b (idénticas) y la tercera c que se distinguió de las
primeras por contener 2 nucleótidos diferentes. Además, las unidades
a y b son transcriptas con mayor frecuencia que la unidad c.
La PCR–RFLP se basa en un análisis bioinformático realizado
con la secuencia de ADN ribosomal de cada especie de Babesia,
se identica el sitio de reconocimiento para B. bovis y B. bigemina
en la parte variable del gen 18S rARN del parásito. La endonucleasa
de restricción AluI cuya secuencia de reconocimiento se ubica en
5’AG↓CT3’, corta al amplicón correspondiente al DNA ribosomal de B.
bigemina de 393 pb, en tres fragmentos de 38, 144 y 211 pb, mientras
que al amplicón correspondiente al DNA ribosomal de B. bovis de 378
pb, lo corta en tres fragmentos de 38, 146 y 194 pb permitiendo así
diferenciar ambas especies [4, 5].
Las técnicas de qPCR–RT explota el llamado principio TaqMan®
fundamentado en la composición química de 5' nucleasa, que utiliza
una sonda uorogénica para habilitar la detección de un producto de
PCR especíco conforme se acumula durante la PCR [15].
Actualmente la Universidad Estatal de Washington está llevando
a cabo los proyectos del genoma de B. bovis y B. bigemina. Hasta el
momento se ha estudiado el genoma de B. bovis cepa Tejas T2Bo, el
cual está constituido por cuatro cromosomas [16]. El genoma completo
de B. bigemina aún no ha sido reportado en una revista indexada.
Sin embargo, el Instituto Sanger, entidad que está secuenciando el
genoma, tiene publicado en su sitio web datos que han permitido la
caracterización, comparación del genoma e identicación de genes
y predicción de secuencias codicantes y proteínas. Se estima que el
genoma nuclear de B. bigemina tiene un tamaño de 10 Mb (un millón de
pares de bases) distribuido en 4 cromosomas [16, 17].
Una vez identificada la B. bigémina por las técnicas de Frotis
coloreado con Giemsa, PCR–RFLP y qPCR–RT, el ADN extraído de
sangre periférica un bovino positivo, acompañado de los cebadores
especícos: PIRO A (5'–TACCCAATCCTGACACACAGGG–3') y PIRO B (5'–
TTAAATACACGAATGCCCCCCCAAC–3'), fue sometido a secuenciación
utilizando los servicios de la Empresa MACROGEN para ser procesados
en Korea del Sur. Se analizan en este artículo las secuencias obtenidas.
MATERIALES Y METODOS
El municipio de Girón está ubicado al Sur – Oeste de la provincia
del Azuay, Ecuador, en la Hoya del Jubones. Tiene una extensión de
346,5 km
2
y lo conforman 2 parroquias rurales: San Gerardo, y La
Asunción. Su altitud está comprendida entre 1.200 a 3.400 m.s.n.m.
con temperaturas promedio de 8 a 15.5°C [18]. La población bovina
actual del Cantón Girón, Ecuador, en la zona alta (más de 2.200 msnm)
es de aproximadamente 4.900 animales, mientras en la zona baja
(menos de 2.200 msnm), la cantidad de animales es de 922 para un
total de 5.822 cabezas de ganado bovino Mestizo Holstein–Criollo, de
varias edades y grupos etarios. La garrapata R. microplus, principal
vector del hemoparásito, fue detectada en la totalidad de los animales
evaluados, incluso los ubicados a niveles a mas de 2.200 msnm.
Las muestras de sangre completa de bovino se analizaron mediante
frotis sanguíneos coloreados con Giemsa [3]. Para detectar las regiones
variables del gen 18S rARN, se realizó una PCR convencional a partir del
ADN con los cebadores PIRO A (5'–TACCCAATCCTGACACACAGGG–3')
y PIRO B (5'–TTAAATACACGAATGCCCCCCCAAC–3'), de acuerdo al
método descrito por Figueroa y col. [5]. Se realizó la visualización
de los productos de PCR mediante eletroforesis en gel de agarosa.
Dicha banda fue puricada, extraída y sometida a digestión con la
enzima de restricción AluI (secuencia de reconocimiento 5’AG↓CT3’)
aplicando la técnica PCR–RFLP previamente descrita por Arboleda–
García [19]. Para la amplicación en tiempo real (qPCR–RT), se utilizó
el kit Primer Design (qPCR) especíco para B. bigemina.
FIGURA 1. Frotis sanguíneo coloreado con Giemsa mostrando glóbulos rojos
infectados con Babesia bigemina
FIGURA 2. Electroforesis de los productos PCR para Babesia bigemina 393pb.;
muestras 40 (positiva), 61(positiva), 62, 66, 72, 73 (negativas); respectivamente.
Carril C– control negativo. Carril MPM Marcador de peso molecular de 100 pb
FIGURA 3. Digestión enzimática con la enzima AluI. Se indica los fragmentos
144 pb y 211 pb para Babesia bigemina. Carriles 1, 2, 3 muestras 46, 54 y 82,
respectivamente. Carril MPM marcador de peso molecular de 100 pb. *El
fragmento esperado de 38 pb, no se observó en el gel
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El ADN de las muestras (20 µL, 30–50 ng gDNA) fue enviado a
secuenciar por la Empresa MACROGEN a Korea del Sur, utilizando
los oligonucleótidos PIRO A For: (3´AATACCCAATCCTGACACAGGG
5´) y PIRO B Rev: (3´TTAAATACGAATGCCCCCAAC 5´) (10 µL de cada
cebador, 5 pmol·µL
-1
).
Para el ensamblaje y análisis de las secuencias se utilizaron los archivos
ab1 obtenidos de la secuenciación Sanger (forward y reverse). Para ello, se
empleó el software Staden Package [20], que consta de dos programas:
Pregap4 y Gap4. Pregap4 se encargó del análisis de calidad y preparación
de los datos, mientras que Gap4 realizó el ensamblaje, vericación,
análisis de pares de lectura, edición de contigs y cálculo de la conanza
de la secuencia consenso. Se utilizó BLASTn para identicar posibles
homólogos (B. bovis y B. bigemina). Se descargaron las secuencias
correspondientes de la base de datos GenBank, considerando que
los hospederos fueran rumiantes, que son generalmente afectados
por estos parásitos. Estas secuencias descargadas se utilizaron para
realizar el alineamiento múltiple, se utilizó el algoritmo Unweighted
Pair Group Method Using Arithmetic Averages (UPGMA) como método
de clasicación, el cual agrupa dos taxones con la mínima distancia,
calculando la media aritmética de las distancias entre ellos. También
se incluyó un grupo externo correspondiente al Plasmodium falciparum
para generar árboles ultramétricos. Se ajustaron los parámetros
sugeridos por el programa MEGA X (versión 10.2.4) [20] y se elaboraron
los dendrogramas correspondientes, representando visualmente las
relaciones logenéticas entre las secuencias analizadas [21].
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La técnica de Frotis coloreado con Giemsa de las muestras
de sangre periférica de bovino permitió observar la B. bigemina
intraeritrocitaria, FIG. 1.
Por PCR estándar se obtuvo una la banda de 393 pb correspondiente
a la B. bigemina, FIG.2.
En la FIG.3 se muestran los resultados de la electroforesis en gel
agarosa al 1,2 %, del producto de la digestión enzimática con la enzima
AluI de la banda de 396 pb, en los pocillos 46, 54 y 82 revelando las
bandas de 211 pb y 144 pb, conrmatorias de la B. bigémina. En el
extremo derecho de la misma gura se encuentra el marcador de peso
molecular que sirvio de guía para determinar el sitio de amplicación,
siendo las bandas más intensas consideradas como positivas.
Por qPCR–TR se obtuvo un resultado de Cq 15,7 para la muestra
Nº 46, seleccionada para secuenciación correspondiente a una
parasitemia alta con 10
7
copias·µL
-1
.
La combinación de las herramientas bioinformáticas utilizadas
permitió obtener resultados precisos de la secuenciación basada
en secuencias de 18S rRNA de especies de babesias, la cual reveló la
distribución de nucleóticos de un cepa designada como la 4623Ba.bi_
GIR–E de B. bigemina, correspondiente a la muestra N.º 46, positiva a
frotis coloreado con Giemsa, PCR– RFLP y qPCR–RT, aislada de sangre
periférica de un bovino infectado perteneciente al municipio Girón
en la provincia de Azuay, Ecuador, ubicado a más de 2.000 msnm. El
producto arrojó una secuencia de 369 pb (>H230420–007_C05_46_
Oligo1.ab1) y de 371 pb (>H230420–007_I07_46_Oligo2.ab1), FIG. 4.
FIGURA 4. File: 46_Oligo1.ab1 Run Ended: 2023/4/20 18:32:22 Signal G:270
A:402 C:537 T:675, Sample: 46_Oligo1 Lane: 29 Base spacing: 13.3753195
369 bases in 4458 scans. File: 46_Oligo2.ab1 Run Ended: 2023/4/20 18:32:22
Signal, G:565 A:1132 C:1578 T:1220, Sample: 46_Oligo2 Lane: 24 Base spacing:
13.033701 371 bases in 4456 scans
FIGURA 6. Dendrograma elaborado con las cepas Babesia bigemina y Babesia bovis
reportadas en Ecuador, Colombia, Brasil, México, USA y South Africa. Se incluyó
un grupo externo (Plasmodium falciparum) para generar árboles ultramétricos
FIGURA 5. Secuencia de la Cepa 4623Ba.bi_GIR–E (11.) cotejada con sonda Bigemina (10.), otras secuencias de Babesia bigemina (13., 14.) y Babesia bovis (15.),
previamente referenciadas (software Staden Package versión 2.0b10, programa Gap4)
Secuencia de la Babesia bigemina en el Ecuador / Bustamante-Ordóñez y cols.____________________________________________________
4 de 6
La cepa 4623Ba.bi_GIR–E y otro aislado de B. bigemina, una cepa
conrmada de B. bigemina y dos cepas de B. bovis fueron cotejada con
una sonda de B. bigemina la cual se alineó con las todas secuencias
de babesias analizadas, FIG. 5.
A partir del análisis de las muestras positivas a B bigemina y otras
especies de babesia detectadas en la zona, se identicaron las
secuencias, modelos matemáticos y estadísticos óptimos para la
elaboración del dendograma.
La secuencia 4623Ba.bi_GIR–E se ubicó cercana a las cepas de
B. bigemina de Ecuador, Brasil, EUA, Colombia y México, agrupada
solamente en el clado de las cepas de B. bigémina analizadas, aparte
del clado de las cepas de B. bovis reportadas previamente en Ecuador y
varios países de Latinoamérica, con porcentajes de homología superiores
al 99 %. La secuencia 4623Ba.bi_GIR–E se ubica en un clado diferente
al del P. falciparum, incluido para el análisis como grupo externo, FIG. 6.
La muestra 4623Ba.bi_GIR–E, mostró 99,24 % de homología con
las cepas de B. bigemina NCBI MH257718.1. de Sudáfrica, MH194392.1
y X59604.1. de Colombia, X59604.1. de México, MH050352.1 de EUA,
FJ42636.1 de Brasil y OL583951.1, OL583950.1 de Ecuador, TABLA I.
Los resultados obtenidos en este trabajo concuerdan con lo publicado
por Chavez–Larrea quien describe dos grandes clados para B. bovis y
B. bigemina [22], en un estudio logenético realizado a partir de las
secuencias descargadas de BLAST y comparadas con 19 muestras
analizadas. En las ramas superiores se encontraban las B. bovis y en las
inferiores B. bigemina. De las 19 muestras evaluadas en dicho estudio se
TABLA I
Especies de Babesia spp. utilizadas en el análisis logenético
Especies Hospedero Ubicación Nro. de acceso
Babesia bovis Vacuno Ecuador OL583937.1
Babesia bovis Vacuno Ecuador OL583942.1
Babesia bovis Vacuno Ecuador OL583935.1
Babesia bovis Vacuno Ecuador OL583944.1
Babesia bovis Vacuno Ecuador OL583934.1
Babesia bigemina Vacuno Colombia MH194385
Babesia bigemina Vacuno Colombia MW227624
Babesia bigemina Vacuno Ecuador OL583950.1
Babesia bigemina Vacuno Brasil FJ426361.1
Babesia bigemina Vacuno EUA MH050356.1
Babesia bigemina Vacuno Sudáfrica MH257718.1
Babesia bigemina Búfalo Colombia MH194392.1
Babesia bigemina Búfalo Colombia MH194389.1
Babesia bigemina Vacuno Mexico X59604.1
Babesia bigemina Vacuno Ecuador OL583951.1
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identicaron 7 genotipos diferentes para muestras similares a B. bovis
y 3 genotipos para secuencias similares a B. bigemina, ligeramente
diferentes entre sí y, a su vez, similares a otros genotipos descritos
en América Latina y el mundo, cerca de aislados de Puerto Rico, Islas
Vírgenes, Uruguay, etc. Otra secuencia de B. bigemina fue similar a los
aislamientos de Cuba, Bolivia y Argentina, cercanos, además, de un
aislamiento de B. bigemina de la India.
CONCLUSIONES
La secuenciación de la región 18S rARN de la cepa 4623Ba.bi_GIR–E
de B. bigemina, aislada de sangre periférica de un bovino infectado,
del municipio Girón en la provincia de Azuay, Ecuador, mostró una
distribución de nucleótidos con alta homología con secuencias de
B. bigemina reportadas en Ecuador, y países latinoamericanos como
Colombia, Brasil y también con secuencias publicadas de otras latitudes
extra continentales. Esto puede indicar posibles procedencias del
patógeno y corroborar la estabilidad genómica del parasito.
Conictos de interés
Los autores declaran que no existen conicto de interés en el
presente estudio.
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