https://doi.org/10.52973/rcfcv-e33239
Recibido: 06/03/2023 Aceptado: 24/04/2023 Publicado: 13/05/2023
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Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, rcfcv-e33239, 1 - 14
RESUMEN
La Brucelosis es una enfermedad zoonótica extendida a nivel
mundial en el ganado bovino, ocasionada principalmente por
Brucella abortus, previamente reportada en ciertas regiones del
Ecuador. La caracterización de las cepas circulantes de Brucella
spp. en ganaderías lecheras resulta importante para comprender la
epidemiología de esta enfermedad. La tipicación bacteriológica de la
Brucella spp. es un proceso lento, riesgoso y requiere de laboratorios
especializados. El objetivo de este estudio fue tipicar las cepas de
Brucella spp. que afectan al ganado bovino en la provincia del Azuay,
mediante ensayos moleculares, a partir de muestras de sangre y
leche de vacas seropositivas a brucelosis. En ncas seropositivas
a ELISA-Indirecto en leche, se seleccionaron 70 vacas Holstein
mestizas, reactoras individualmente a las pruebas Rosa de Bengala
y conrmadas con ELISA competitivo. Se extrajo el ADN de esas
muestras de sangre y leche conrmando en un inicio la viabilidad
del material genético de bovino con oligonucleótidos especícos
para el género Bos. La amplicación de ADN para Brucella spp. se
realizó por PCR-AMOS con cebadores de genero para la región IS711
y de especie para Brucella abortus, Brucella mellitensis, Brucella
suis y Brucella ovis. Se pudo identicar ADN bovino en 65 (92,8 %)
muestras de leche y en 62 (88,5 %) muestras de sangre. Un total de
62 muestras de ADN extraído de leche resultaron positivas (95,4 %)
al género Brucella spp. y todas las muestras de sangre resultaron
negativas. El PCR-AMOS mostró bandas con un peso molecular de
498 pb en muestras de cuatro animales correspondiente a B. abortus.
Este es el primer estudio de identicación molecular en la provincia
del Azuay con evidencia cientíca de la especie de Brucella spp.
circulante en las ganaderías bovinas de la zona, contribuyendo de
base para la identicación futura de los biovares de B. abortus aún
no reportados en esta zona del país.
Palabras clave: PCR-AMOS; B. abortus; IS711; ELISA–I; ELISA–C
ABSTRACT
Brucellosis is a worldwide zoonotic disease in cattle, caused mainly
by Brucella abortus previously reported in certain regions of Ecuador.
The characterization of circulating strains of B. abortus in dairy
herds is vital to understand the epidemiology of this disease. The
bacteriological typing is a slow, risky process and requires specialized
laboratories for Brucella spp. The aim of this study was to type the
strains of Brucella spp. that affect bovines in the Province of Azuay,
through molecular assays, from blood and milk samples from cows
seropositive to brucellosis. In farms seropositive to ELISA-Indirect in
milk, 70 Holstein crossbred cows were selected, individually reacting
to the Rose Bengal tests and conrmed with competitive ELISA.
The DNA was extracted from these blood and milk samples, initially
verifying the viability of the bovine genetic material with specic
oligonucleotides for the Bos genus. The DNA amplication for Brucella
spp. It was performed by PCR-AMOS with genus primers for the IS711
region and Species primers for Brucella abortus, Brucella mellitensis,
Brucella suis and Brucella ovis. Bos DNA could be identied in 65
(92.8%) milk samples and in 62 (88.5%) blood samples. A total of
62 (95.4%) DNA samples extracted from milk were positive for the
genus Brucella spp. All blood samples were negative. The PCR-AMOS
showed bands with a molecular weight of 498 base pairs in samples
from four animals corresponding to B. abortus. This is the rst study
of molecular identication in the Province of Azuay with scientic
evidence of the species of Brucella spp. circulating in the herds of
the area, serving as a basis for the future identication of B. abortus
biovars not yet reported in this area of the Country.
Key words: PCR-AMOS; B. abortus; IS711; ELISA-I; ELISA – C
Tipicación molecular de especies de Brucella en ganaderías lecheras de la
provincia del Azuay – Ecuador
Molecular typing of Brucella species in dairy farms in the Province of Azuay – Ecuador
Omar Santiago Andrade-Guzmán
1
* , Antonio Javier Vallecillo
2
, Andrea Elizabeth Vintimilla-Rojas
1
, Andrés Norberto Haro-Haro
1
,
Ivanna Solmayra Agreda-Orellana
3
, Daniela Alejandra Vintimilla-Rojas
4
y Sergio Emiro Rivera-Pirela
5
1
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Laboratorio de Microbiología y Lácteos. Cuenca, Ecuador.
2
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Laboratorio de Biología Molecular. Cuenca, Ecuador.
3
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Médicas, Laboratorio de Microbiología. Cuenca, Ecuador.
4
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Médicas. Cuenca, Ecuador.
5
Universidad de Zulia, Facultad de Ciencias Veterinarias. Maracaibo, Zulia, Venezuela.
*Autor de correspondencia: omar.andrade@ucuenca.edu.ec
Identificación molecular de Brucella en Ecuador / Andrade-Guzmán y col. _________________________________________________________
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INTRODUCCIÓN
La brucelosis es una enfermedad zoonótica extendida en el mundo,
afecta a animales domésticos y silvestres [28]. Provoca pérdidas
económicas causando abortos, retención placentaria, reducción de la
producción láctea, nacimiento de crías débiles infectadas o muertas
e infertilidad. Afecta el comercio internacional y obliga al sacricio
de animales seropositivos [10]. La transmisión al humano ocurre por
el consumo de leche y productos lácteos contaminados, inhalación
de partículas en aerosol y contacto directo con tejidos de animales
infectados [26]. Las fuentes de infección para los animales incluyen
materiales biológicos como fetos abortados, secreciones vaginales,
leche, semen, agua y alimentos contaminados; la infección en terneros
es posible a través del útero y por el consumo de calostro [24]. Los
enfoques logenéticos demuestran la preferencia del hospedador
y la virulencia por lo que se han denido doce especies de Brucella
(B): B. abortus (bovino), B. mellitensis (caprino), B. suis (porcino),
B. canis (canino), B. ovis (ovino), B. neotomae (rata de bosque) [41].
B. ceti (delnes, marsopas y ballenas), B. pinnipedialis (focas), B.
microti (topillo común) y B. inopinata (humano, rana toro) el reciente
aislamiento de B. papionis en babuinos y B. vulpis hallada en ganglios
linfáticos mandibulares de zorros rojos, incrementan su diversidad
[2, 11]. B. mellitensis, B. abortus y B. suis son las tres especies
generalmente asociadas con enfermedades humanas sin poder
descartar cierto grado de patogenicidad de B. canis, B. ceti y B. microti
[5, 29]. En Ecuador, el diagnóstico ocial de la brucelosis bovina es
realizado mediante pruebas serológicas como Rosa de Bengala (RB)
y utilizando como prueba conrmatoria el ELISA competitivo (ELISA-
C). Se reportan diferentes prevalencias y variación entre regiones,
incluso dentro de ellas. El primer estudio en Ecuador realizado por
Agrocalidad en el año 1979 reere una prevalencia en la región Sierra
Norte de 1,92–10,62 %, en la región Costa de 4,12–10,62 % y en la región
Sierra Sur de 1,30–2,60 % ubicándose una prevalencia nacional en 6 %
[30]. Otros estudios más actualizados reportan prevalencias a nivel
de granja de 17 % y por animales 10 % [8, 35]. El cultivo bacteriano se
considera la prueba de oro para el diagnóstico de esta enfermedad,
sin embargo, este proceso puede requerir de hasta siete semanas,
es muy riesgoso para el personal que lo realiza pues requiere de
laboratorios de bioseguridad BSL3. Adicionalmente la biotipicación
requiere mucho tiempo y a menudo es difícil de interpretar debido a
la limitada estandarización de los reactivos [16]. En Ecuador se han
aislado en bovinos, cepas de B. abortus bv.1, 2 y 4 [34, 37].
Una estrategia molecular para diferenciar entre especies de
Brucella spp. se basa en la identicación del polimorsmo de la
distribución y el número de copias de la secuencia de inserción IS711
en el genoma, mediante un PCR múltiple (PCR–AMOS), que genera
fragmentos cuyos tamaños son distintivos para cada especie. Este
ensayo permite diferenciar B. abortus, B. mellitensis, B. ovis, B. suis y
las cepas vacunales de B. abortus S19 y RB51 [6, 7]. En la provincia del
Azuay, si bien existe evidencia serológica de la presencia de brucelosis
bovina en hatos ganaderos en la actualidad no se ha reportado el
aislamiento de esta bacteria como sucede en otras regiones del
país [23].
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue identicar el material
genético de la cepa predominante de Brucella spp. en animales
seropositivos de la provincia de Azuay – Ecuador.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio y población
La población consistió en 70 vacas Holstein mestizas (Bos taurus)
en lactancia procedentes de 13 ganaderías ubicadas en los cantones
Cuenca, San Fernando, Girón, Sevilla de Oro, Sígsig y Nabón de la
Provincia del Azuay en Ecuador. Los animales fueron identicados
seropositivos mediante las pruebas RB y conformados con ELISA-C,
los mismos que procedían de granjas previamente identicadas como
seropositivos a Brucelosis mediante el análisis en tanques de leche,
con la prueba ELISA-I en un estudio de prevalencia llevado a cabo en
los años 2020 y 2021 en esta provincia [4]. Las ganaderías incluidas
en este estudio no formaban parte de los programas ociales de
control de Brucelosis y estaban exentas de vacuna.
Toma de muestras
Se recolectaron muestras de sangre y leche de todas las vacas
que aportaron a la mezcla en los tanques de leche seropositivos a
brucelosis con ELISA-I en el mencionado estudio en la zona. Para las
pruebas serológicas se tomaron 10 mililitros (mL) de sangre en tubos
Vacutainer (SENNA Cientíca, EUA) sin anticoagulante. Para extracción
de ácido desoxirribonucleico (ADN) se tomó 4 mL en tubos con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA). La leche fue colectada en envases
plásticos estériles, se tomó 100 mL y se transportó en cajas térmicas
(Coleman, Alemania) a 4°C al laboratorio de Biología Molecular de la
Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca, en
donde alícuotas de las muestras de leche y sangre se congelaron a
-20°C (Congelador Indurama, Ecuador) para su posterior procesamiento.
Serología para identicación de animales expuestos a Brucella spp.
Las muestras de sangre sin anticoagulante se centrifugaron a
10.000 G (Dynac, Clay Adams, EUA) durante 10 minutos (min) para
extraer el suero, a éstos se les realizó la prueba RB (IDEXX, 2020) y se
utilizó el kit de ELISA-C (Svanova, Suecia) como prueba conrmatoria,
según las indicaciones del fabricante.
Extracción de ADN de muestras de sangre y leche
Las muestras de sangre de animales seropositivos recolectadas
en tubos EDTA fueron descongeladas y fraccionadas en alícuotas
de 200 microlitros (µL) para la extracción de ADN total mediante el
método con detergente catiónico bromuro de hexadecil-trimetil-
amonio (CTAB), fenol-cloroformo modicado [12]. Se añadió 200
µL de buffer de lisis, 40 milimoles (mM) de Tris-HCl, pH 8,0; 200
mM de NaCL, 8 mM de EDTA, 2 % de SDS, 10 µL de una solución
de proteinasa K (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM de EDTA; 50 mM de
glicerol y 5 mg·ml
-1
de Proteinasa K). Se incubaron las muestras
durante 14 horas a 56°C, posteriormente se adicionaron 500 µL de
fenol cloroformo, se homogenizó la mezcla en un vortex (V2H-BOECO,
Alemania) y se centrifugaron a 12.000 G (Eppendorf 5430R, Alemania)
a 4°C durante 10 min. Se separó el sobrenadante y se añadió 260
µL de etanol absoluto. Se realizó una segunda centrifugación, se
eliminó el sobrenadante, se añadió etanol al 70 % y se centrifugó
para eliminar el etanol. El sedimento de ADN fue secado durante 24
horas a temperatura ambiente para nalmente adicionar 20 µL de
agua grado biología molecular (Corning. Cientíca Senna, EUA) el
ADN extraído se conservó a -20°C.
Para la extracción de ADN de las muestras de leche se empleó la
metodología modicada de Romero [36]. Se centrifugaron 2 mL de las
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muestras a 6.000 G durante 10 min a 4°C. Posteriormente se recolectó
la capa de grasa en una cantidad de 500 µL, se le adicionaron 100 µL de
buffer NET (50 mM de NaCL; 125 Mm de EDTA y 50 mM de Tris-HCl, pH
7,6) y 100 µL de una solución de dodecilsulfato sódico (SDS) al 24 %; se
mezcló con un vortex por 30 segundos (seg) y se incubó a 80°C en una
estufa (Termo Fisher Scientic, EUA) durante 10 min, posteriormente
se añadieron 50 µL de solución de proteinasa K, se homogenizó e
incubó durante 2 h a 50°C. Para precipitar los detritos, se añadió 125
µL de la solución de NaCl y 100 µL de una solución de CTAB al 10 % y se
incubó la mezcla a 65°C por 10 min. Consecutivamente, las muestras se
centrifugaron a 12.000 G durante 10 min a 4°C, se recolectaron 400 µL
del sobrenadante y se adicionaron 2,5 volúmenes de etanol absoluto frio
a 4°C para precipitar el ADN total, se mezcló por inversión y centrifugó a
12.000 G durante 10 min a 4°C, una vez eliminado el etanol absoluto por
decantación, se realizó un lavado del sedimento de ADN con la adición
de 500 µL de una solución de etanol al 70 % y posterior se centrifugó
a 12.000 G durante 10 min a 4°C. Finalmente se eliminó la solución de
etanol al 70 %, se secó el precipitado a temperatura ambiente que fue
suspendido en 50 µL de agua biología molecular.
Control de proceso para evaluación de procedimiento de obtención
de ADN total
Se realizó el control de proceso mediante PCR para vericar la
viabilidad del material genético de bovino según la metodología
descrita por López-Calleja [21]. Se utilizaron oligonucleótidos
especícos para el género Bos (TABLA I) que hibridan en el gen de
la subunidad 12S ribosomal del genoma mitocondrial y generan un
producto de 708 pares de bases (pb), aproximadamente. La mezcla
de la PCR (25 µL) consistió en 1X del buffer de reacción (50 mM de
Tris-HCl, Ph 8,5; 50 mM de NaCL; 0,1 mL de BSA), 200 micromoles
(µM) de cada uno de los dNTP´s; 1,4 mM de MgCl
2
; 0,8 µM de cada uno
de los primers, 0,04 unidades (U) de Taq ADN polimerasa (Go-Tag
Flexi DNS polymerase, Promega, Madison, EUA). El perl de tiempo
y temperatura para generar los amplicones del material genético
de bovino se realizó con un termociclador (Eppendorf, Alemania) y
consistió en: desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, seguido de
35 ciclos de 45 seg a 94°C, hibridación por 30 seg a 60°C, y extensión
por 45 seg a 72°C y un paso de extensión nal fue 5 min a 72°C. Los
productos de amplicación se fraccionaron en un gel de agarosa
al 1 %, teñido con 1 µL de bromuro de etidio, se utilizó una cámara
de electroforesis (Biometra P-30-BI, Germany) aplicando 90 voltios
durante 45 min. El gel se visualizó empleando un fotodocumentador
ultravioleta (Bio-Rad, EUA).
Amplicación de ADN de la cepa vacunal RB51
Para validar los cebadores que amplican mediante PCR – IS711
la secuencia del género Brucella spp. y que generan un producto de
261 pb (TABLA I), se utilizó como control positivo ADN extraído de la
vacuna RB51 y como control negativo agua grado biología molecular.
La mezcla para cada reacción fue de 20 µl, el master mix se realizó
con 2,5 U·µl
-1
de Taq polimerasa, 10X de Buffer; 50 mM de MgSO
4
;
0,25 µl de dNTPs; 0,2 µl de cada cebador; 2 µL de ADN, solución 10X
enhancer 1,875 µl. El protocolo de temperatura para la amplicación
incluyó una desnaturalización inicial a 95°C durante 5 min, seguido de
40 ciclos a 94°C por 45 seg, hibridación a 58°C durante 25 s, extensión
68°C durante 5 min y una extensión nal de 68°C durante 5 min. Para
observar los productos de la reacción se realizó una corrida en gel
de agarosa según lo descrito anteriormente.
Amplicación de ADN del género Brucella spp.
La amplificación de ADN del género Brucella spp. se realizó
utilizando los protocolos de secuencia de inserción PCR-IS711
previamente descritos con el que se obtiene una banda con peso
molecular de 261 pb [16]. Los cebadores usados se detallan en la
TABLA I; cada reacción tuvo un volumen nal de 20 µL, el master mix
se realizó con 1X de Taq polimerasa, 1X de Buffer, 1,5 mM de MgCl
2
,
0,02 de dNTPs, 0,02 mM de cada cebador y 10 µL de ADN. El protocolo
de temperatura para la amplicación incluyó una desnaturalización
inicial a 94°C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 94°C por 45 seg,
hibridación a 54°C durante 30 seg, extensión 72°C durante 45 seg y
una extensión nal de 72°C durante 5 min. Se realizó electroforesis
al gel de agarosa durante 45 min a 100 voltios. Se analizaron 10 µl de
productos de PCR por electroforesis a través de gel de agarosa al
1,5 % teñido con solución de bromuro de etidio (1 µL) y se visualizó
con el fotodocumentador.
Amplicación de ADN de especies de Brucella mediante PCR-AMOS
Se utilizó la técnica PCR-AMOS antes descrita, con una combinación
de cinco cebadores (TABLA I). El cebador del gen IS711 que hibrida
con la secuencia de inserción de cuatro cebadores específicos
generando amplicones de diferentes tamaños según la especie; B.
abortus (498pb), B. mellitensis (731 pb), B. suis (285 pb), B. ovis (976 pb).
La PCR se realizó tomando un volumen de 25 μL compuesto por 0,3
mM de dNTPs, 1X buffer, 1,5 mM de MgCl
2
0,2 mM de cada cebador, 1 (U)
de Taq polimerasa y 30 nanogramos·µL
-1
(ng·µL
-1
) de ADN genómico.
Las condiciones de amplificación incluyeron desnaturalización
inicial a 94°C por 10 min seguido de 30 ciclos de desnaturalización
a 94°C por 30 seg, recocido a 60°C por 30 seg, extensión a 72°C por
2 min y una extensión nal a 72°C durante 5 min. Los productos de
la reacción de cadena de polimerasa (PCR) se visualizaron después
de la electroforesis en gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro
de etidio empleando el fotodocumentador ultravioleta. Se usó un
marcador de peso molecular escala de 100 pb (Gibco-BRL) como
estándar de tamaño.
TABLA I
Cebadores usados en este estudio
Cebador
(nombre)
Secuencia (5´–3´) Amplicon Referencia
PCR de control de proceso (Género Bos)
12SFW-Mod TAAATCTCGTGCCAGCCA
708 pb
[24]
12SREV-Mod AGTATGCTTACCTTGTTACGAC
PCR-IS711 para identicación Brucella spp (Género Brucella)
IS6501 3’ GATAGAAGGCTTGAAGCTTGCGGAC
261 pb
[17]
IS6501 5’ ACGCCGGTGTATGGGAAAGGCTTTT
PCR–AMOS para identicación de especies de Brucella
IS711 TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT
B. abortus GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC 498 pb
[6]
B. mellitensis AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA 731 pb
B. ovis CGGGTTCTGGCACCATCGTCG 976 pb
B. suis GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG 285 pb
FIGURA 1. Imágenes representativas de la resolución de los
ensayos de PCR para la evaluación de la viabilidad del ADN total
obtenido de las muestras colectadas de los bovinos seropositivos
a brucelosis. A. Productos de PCR del ADN total obtenido de las
muestras de leche (Carriles 1, 2, 3, y 4); control positivo (Carril
5) y control negativo (Carril 6) resueltos en gel de agarosa-TAE
teñido con Bromuro de etidio. Carril MPM, marcador de peso
molecular (GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder, Cat. no.: SM1331). B.
Electroforesis de los productos de PCR del ADN total obtenido de
las muestras sanguíneas (Carriles 1, 2, 3, y 4); control negativo
(Carril 5) y control positivo (Carril 6). Carril MPM, marcador de
peso molecular (TrackIt™ 100 pb DNA ladder, Cat. no. 10488058)
FIGURA 2. Resolución de ensayo de PCR–IS711 para la optimización
de las condiciones de la temperatura de hibridación de los primers
para la identicación de material genético de bacterias del género
Brucella. Se muestran los productos de PCR con el tamaño esperado
(261 pb) al emplearse ADN total de la cepa vacunal RB51 derivada de
B. abortus 2308 (Carriles 1, 2, 3, 4, y 5). Carril MPM, marcador de peso
molecular (TrackIt™ 100 pb DNA ladder, Cat. no. 10488058)
Identificación molecular de Brucella en Ecuador / Andrade-Guzmán y col. _________________________________________________________
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Viabilidad de las muestras de ADN total mediante el control de
proceso
La amplificación de ADN bovino mediante PCR demostró un
producto de 708 pb en 65 (92,8 %) muestras de leche (FIG.1A) y en 62
(88,57 %) muestras de sangre (FIG. 1B) de los 70 animales conrmados
seropositivos, que corresponden a una secuencia especíca del
género Bos, lo cual indica que este material genético es viable para
identicar ADN de Brucella spp.
La extracción de ADN es una fase crítica para la detección, no solo
de Brucella en leche o sangre, si no para cualquier microorganismo
que pueda ser detectado en estos tipos de muestras. El éxito de la
amplicación con PCR está relacionado con la calidad y cantidad
del ADN obtenido [25]. En relación al porcentaje de muestras de
leche que no amplicaron ADN total, es conocido que los extractos
de ADN de este uido son difíciles de obtener, esto podría estar
relacionado con las características físicas, químicas y biológicas de la
leche, como las moléculas de grasa, proteína y calcio, conjuntamente
con desechos bacterianos [3]. Las plasminas pueden servir como
inhibidores naturales en la leche capaces de degradar las polimerasas
Taq [40]. En sangre hay varios estudios que mencionan que los tubos
adicionados con EDTA son buenos para conservar este tejido, pero
el almacenamiento prolongado en congelación y la descongelación
podría ocasionar un bajo rendimiento de la prueba. Hay diversos
métodos disponibles para la extracción de ADN en sangre basados
en lisis química y mecánica de las células, reportándose resultados
ambiguos en base a su rendimiento individual, dependiendo del tipo
de tejido a analizar, tiempo de recolección, detergentes usados y su
concentración, esto explicaría por qué no se pudo amplicar ADN
bovino del total de las muestras de sangre analizadas [15].
PCR–IS711 para amplicación de ADN de cepa vacunal
La vacuna RB51 es una cepa mutante rugosa atenuada derivada de
la cepa virulenta de B. abortus 2308, cuyo ADN se usó como control
positivo que al someterse al PCR–IS711 arrojó un amplicon de 261
pb (FIG. 2), conrmando que el método de extracción y el protocolo
de temperatura usados son aptos para identicar la presencia de
ADN genérico de Brucella spp. en las muestras de leche y sangre
bovina. Estudios previos indicaron que el gen wboA, que codica
una glicosiltransferasa necesaria para la síntesis del O-polisacárido,
está interrumpido en la cepa RB51 por un elemento IS711 [39], este
polimorsmo fue elegido como el locus objetivo en este ensayo.
PCR-IS711 para amplicación de ADN del género Brucella spp.
Como resultado del producto de PCR–IS711 se observaron
amplicones de 261 pb únicamente en 62 (95,4 %) muestras de leche
de las 65 que amplicaron al control de proceso, que pertenecen a
FIGURA 3. Resolución de los ensayos de PCR-IS711 para la
identicación de material genético de bacterias del género Brucella
en las muestras de leche procedente de bovinos seropositivos a
brucelosis. Productos de PCR con el tamaño esperado (261 pb)
observados en control positivo (Carril 6) y en una muestra (Carril 3);
y ausentes en el control negativo (Carril 5) y en los carriles 1, 2 y 4.
Carril MPM, marcador de peso molecular (GeneRuler 1 kb Plus DNA
ladder, Cat. no. SM1331)
FIGURA 4. Resolución de ensayos de PCR-AMOS para la identicación de material genético de especies del género Brucella en las muestras de
leche positivas a Brucella spp. Productos de PCR con el tamaño esperado (498 pb) observados en los controles positivos (Carril 12 y 14 B. abortus
RB51) y en muestras (Carriles 1 y 5); y ausentes en el control negativo (Carril 13) y en los carriles 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 y 10. Carril MPM, marcador de
peso molecular (100pb Plus Opti-DNA Markers, Cat. no. G016)
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una región del segmento de inserción IS711. Esto corresponde a la
amplicación del locus ery relacionada a una región de los genes
eryC – eryD, encargados del catabolismo del eritritol en todos los
miembros del género Brucella spp. [42]. (FIG. 3). Todas las muestras
de sangre resultaron negativas al IS-711.
ADN de leche se considera aceptable, cuando tiene un equivalente en
bacterias de 10 UFC·mL
-1
[19]. Esto coincide con lo manifestado por
Rentería [32] quien ubica el límite de detección de la prueba PCR en
leche en 1 ng de ADN, lo que equivale aproximadamente a 3×10
5
células
de B. abortus. Otros factores que inuirían para la no detección de ADN
del género Brucella en muestras de leche pudieran ser los cambios
en el pH, temperatura de almacenamiento y la descongelación de las
muestras lo que afectaría la integridad del ADN [13, 14].
Era de esperarse que en muestras sanguíneas no se encontrase ADN
de la bacteria debido a que la bacteremia de este germen en la especie
bovina es muy corta comparada con otras especies. El sedimento
de glóbulos blancos puede ser una valiosa plantilla para su uso en la
detección de Brucella spp. por PCR, pero esto dependerá si el animal
se encuentra en una etapa aguda o crónica de la enfermedad. Las
muestras en este trabajo procedían de animales que se diagnosticaron
mediante pruebas serológicas de rutina sin poderse precisar el tiempo
de infección, generalmente vacas adultas de varias lactancias.
La Brucella spp. es una bacteria intracelular facultativa, fagocitada
rápidamente por macrófagos y neutrófilos desde su ingreso al
organismo por diferentes vías (aerosol, conjuntival, oral o parenteral),
para ser transportada luego hacia los tejidos de preferencia en
los diferentes órganos, tales como, la médula ósea, el líquido
cefalorraquídeo, hígado, riñones, bazo, útero y testículos, dicultando
su aislamiento en sangre periférica [9].
PCR–AMOS
En este estudio se utilizaron los oligonucleótidos descritos
anteriormente como PCR–AMOS capaces de amplicar los fragmentos
que permiten la diferenciación de B. abortus, B. mellitensis, B. ovis y B.
suis. Como resultado de esta amplicación se obtuvo amplicones de
498 pb característico de B. abortus en muestras de leche aislados de
cuatro animales seropositivos provenientes del cantón San Fernando
en la provincia del Azuay (FIG. 4).
Las limitaciones de los procedimientos de detección serológica
y de aislamiento microbiológico han fomentado el uso de métodos
moleculares para la detección e identificación de especies de
Brucellaspp. debido a su precisión, sensibilidad, velocidad y capacidad
Las muestras de leche que no amplicaron al PCR IS711 (genérico)
a pesar de estar serológicamente positivas a brucelosis, sugieren
que este microorganismo no se excreta de manera constante o las
concentraciones bacterianas no fueron lo sucientemente altas en
unidades formadoras de colonia (UFC) para ser detectadas. Algunos
autores maniestan que el nivel de detección de la PCR a partir de
Identificación molecular de Brucella en Ecuador / Andrade-Guzmán y col. _________________________________________________________
6 de 14
para trabajar con ADN, en oposición a cultivos bacteriológicos muy
lentos, imprecisos y altamente riesgosos [17].
Sobre la base de los resultados, no se identificaron patrones
moleculares que sugieran una infección cruzada con otra especie
como agente causal de brucelosis en esta región, como lo corroboran
estudios previos, indicando que B. abortus es la principal especie
circulante en ganaderías del Ecuador [22]. De igual manera
Rodríguez y col. [33] en la provincia de Santo Domingo, al utilizar los
protocolos PCR–IS711 y PCR–AMOS en muestras de sangre y ganglios
supramamarios identicaron B. abortus (biovar 1 y 4) como cepas
circulantes en vacas procedentes de hatos seropositivos.
Así también, Ojeda-Gutiérrez y col. [27] reporta en la provincia
de Zamora Chinchipe la presencia de este agente en muestras de
sangre de bovinos provenientes de ncas ganaderas al usar cebadores
que amplican un fragmento de 223 pb, los cuales reconocen una
región interna de la secuencia del gen bcsp31, que se conserva en
todas las especies de Brucella. Igualmente, Ron y col. [38] aíslaron
B. abortus (biovar 4) mediante técnicas moleculares en poblaciones
humanas de las provincias de Carchi y Pichincha, cuyas actividades
estaban relacionadas con granjas lecheras y centros de faenamiento
en zonas con alta prevalecía de brucelosis bovina. Datos similares
fueron reportados en otros países al identicar ADN de B. abortus y B.
mellitensis en muestras de leche y sangre en vacas y búfalos (Bubalus
bubalis) bajo las mismas condiciones de este estudio [1, 18, 20].
Como se indicó inicialmente, las muestras de sangre y leche
procedían de vacas en periodo de lactancia obtenidas de ganaderías
que se identicaron seropositivas mediante la prueba ELISA–I en
mezclas de leche, por lo que no se incluyeron hembras en periodo
de secado, ni machos. Los signos clínicos provocadas por Brucella
spp. en los animales infectados generalmente se relacionan con
problemas reproductivos como aborto, infertilidad, retención de
placenta y nacimiento de terneros débiles entre otros [43].
Según la encuesta epidemiológica que se realizó para determinar
el estatus sanitario de las ncas donde se obtuvieron las muestras,
algunos propietarios no reportaron problemas reproductivos en los
animales, a pesar de que se encontraron anticuerpos en las mezclas
de leche, probablemente relacionado con una etapa temprana de
la infección, cuando la cantidad de bacterias en circulación en el
momento de la recolección de muestras en vacas preñadas es
inferior a la observada durante una infección crónica, replicándose
preferentemente dentro del trofoblasto corioalantoideo de la placenta,
lo cual provoca placentitis, muerte fetal y aborto [31]. Las muestras
que resultaron positivas a PCR–AMOS procedían de ncas donde hubo
antecedentes de abortos en el último tercio de gestación y no contaban
con plan de inmunización ocial contra esta enfermedad.
Este estudio constituye el primer reporte de tipicación molecular
de B. abortus mediante PCR–AMOS en leche, como agente causal
de brucelosis bovina en la provincia del Azuay en Ecuador. Esta
información sin duda contribuirá a la comprensión sobre la dinámica
epidemiológica de la enfermedad y servirá de apoyo al programa de
vigilancia y control de la brucelosis en la región.
CONCLUSIONES
Se pudo amplicar con éxito en la mayoría de muestras de leche
de vacas seropositivas una región del genoma de Brucella usando el
elemento genético IS711 para género, siendo la leche el uido de mayor
utilidad para el diagnóstico molecular de este patógeno, si bien se logró
identicar mediante PCR–AMOS el material genético de B. abortus
como agente causal de la brucelosis bovina en ganaderías lecheras
del Azuay, los resultados obtenidos sugieren que el PCR especico
no es tan sensible como el de género, por ello se recomienda realizar
otras investigaciones para aislar e identicar los biovares presentes
en esta zona y determinar su distribución para contribuir a una mejor
comprensión de la brucelosis bovina en la región.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio fue nanciado con fondos de la XVIII convocatoria
para proyectos de investigación de la Dirección de Investigación de
la Universidad de Cuenca (DIUC).
Conicto de Intereses.
Los autores maniestan que no existe ningún conicto de interés.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] AL DAHOUK, S.; KÖHLER, S.; OCCHIALINI, A.; JIMÉNEZ DE
BAGÜÉS, M. P.; HAMMERL, J. A.; EISENBERG, T.; VERGNAUD, G.;
CLOECKAERT, A.; ZYGMUNT, M.S.; WHATMORE, A.M.; MELZER, F.;
DREES, P.; FOSTER, T.; WATTAM, A.R.; SCHOLZ, H. C. Brucella spp. of
amphibians comprise genomically diverse motile strains competent
for replication in macrophages and survival in mammalian hosts.
Sci. Rep. 16(7) e44420. 2017. https://doi.org/f9t5z2
[2] ABD AL-AZEEM, M.W.; MUSTAFA ELMALT, L.; ZAIN EL ABDEIN,
A. E.; HELMY SAYED, H. Molecular and serological studies on
detection of Brucella species in cattle and buffaloes.J. Pharm.
Biomed. Sci. 2(3): 16–24. 2012. https://bit.ly/40J8Gxd. 20/02/2023
[3] ALIYEV, J.; ALAKBAROVA, M.; GARAYUSIFOVA, A.; OMAROV,
A.; ALIYEVA, S.; FRETIN, D.; GODFROID, J. Identication and
molecular characterization of Brucella abortus and Brucella
melitensis isolated from milk in cattle in Azerbaan. BMC Vet.
Res. 18(1): 1–9. 2022. https://doi.org/gp9q9b
[4] ANDRADE, O.; LÓPEZ, M.; VINTIMILLA, A.; LUPERCIO, R.;
BUSTAMANTE, J.; DUTÁN, J.; RIVERA, S.; GUEVARA, G. Ecacia
de la prueba ELISA en muestras de leche para la vigilancia
epidemiológica de la brucelosis bovina. Arch. Latinoame. Prod.
Anim. 30(2): 67–69. 2022. https://doi.org/j7np
[5] AWAH-NDUKUM, J.; MOUICHE, M.M.M.; KOUONMO-NGNOYUM,
L.; BAYANG, H.N.; MANCHANG, T.K.; POUEME, R.S.N.; KOUAMO,
J.; NGU-NGWA, V.; ASSANA, E.; FEUSSOM, K. J. M.; ZOLI,
A.P. Seroprevalence and risk factors of brucellosis among
slaughtered indigenous cattle, abattoir personnel and pregnant
women in Ngaoundéré, Cameroon. B.M.C. Infect. Dis. 18(1): 1–13.
2018. https://doi.org/48rn
[6] BRICKER, B.J.; HALLING, S.M. Differentiation of Brucella abortus
bv. 1,2 and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, and Brucella suis
bv. 1 by PCR. J. Clin. Microbiol. 32(11): 2660–2666. 1994. https://
doi.org/j8dx
[7] BRICKER, B.J.; HALLING, S.M. Enhancement of the Brucella
AMOS PCR assay for differentiation of Brucella abortus vaccine
strains S19 and RB51. J. Clin. Microbiol. 33(6): 1640–1642. 1995.
https://doi.org/j8dz
______________________________________________________________________Revista Cientifica, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, rcfcv-e33239, 1 - 14
7 de 14
[8] CARBONERO, A.; GUZMÁN, L. T.; GARCÍA-BOCANEGRA, I.;
BORGE, C.; ADASZEK, L.; ARENAS, A.; SAA, L.R. Seroprevalence
and risk factors associated with Brucella seropositivity in dairy
and mixed cattle herds from Ecuador.Trop. Anim. Health
Product. 50(1): 197–203. 2018. https://doi.org/gcxdsz
[9] DAL, T.; KARA, S.S.; CIKMAN, A.: BALKAN, C.E.; ACIKGOZ, Z.C.;
ZEYBEK, H.; DURMAZ, R. Comparison of multiplex real-time
polymerase chain reaction with serological tests and culture
for diagnosing human brucellosis.J. Infect. Publ. Health.12(3):
337–342. 2019. https://doi.org/48qt
[10] DOGANAY, M.; AYGEN, B. Human brucellosis: An overview.
Internat J. Infect. Dis. 7 (3): 173–182. 2003. https://doi.org/djsgvp
[11] FERO, E.; JUMA, A.; KONI, A.; BOCI, J.; KIRANDJISKI, T.; CONNOR,
R.; WARETH, G.; KOLECI, X. The seroprevalence of brucellosis
and molecular characterization of Brucella species circulating
in the beef cattle herds in Albania. PLoS ONE. 15(3): 1–14. 2020.
https://doi.org/48ff.
[12] GHAHERI, M.; KAHRIZI, D.; YARI, K.; BABAIE, A.; SUTHAR, R.S.;
KAZEMI, E. A comparative evaluation of four DNA extraction
protocols from whole blood sample. Cell. Mol. Biol. 62(3): 119–123.
2016. https://doi.org/j8d3.
[13] GODFROID, J.; SCHOLZ, H.C.; BARBIER, T.; NICOLAS, C.;
WATTIAU, P.; FRETIN, D.; WHATMORE, A.M.; CLOECKAERT, A.;
BLASCO, J.M.; MORIYON, I.; SAEGERMAN, C.; MUMA, J.B.; AL
DAHOUK, S.; NEUBAUER, H.; LETESSON, J.J. Brucellosis at the
animal/ecosystem/human interface at the beginning of the 21st
century. Prev. Vet. 102(2): 118–131. 2011. https://doi.org/c39d67
[14] GOUD, T.S.; UPADHYAY, R.C.; KUMAR, A.; KARRI, S.; CHOUDHARY,
R.; ASHRAF, S.; SINGH, S.; KUMAR, O.; KIRANMAI, C. Novel
extraction of high quality genomic dna from frozen bovine blood
samples by using detergent method. Open Vet. J. 8(4): 415–422.
2018. https://doi.org/gfrxmg
[15] HALLING, S.M.; TATUM, F.M.; BRICKER, B.J. Sequence and
characterization of an insertion sequence, IS711, from Brucella
ovis. Gene. 133(1): 123–127. 1993. https://doi.org/c3m6fx.
[16] HAMDY, M.E.R.; AMIN, A.S. Detection of Brucella species in the
milk of infected cattle, sheep, goats and camels by PCR. Vet.
J. 163(3): 299–305. 2002. https://doi.org/fbhphh
[17] KILIÇ, S.; ÇELEBI, B.; TURAN, M. Brucella mellitensis and Brucella
abortus genotyping via real-time PCR targeting 21 variable genome
loci. J. Microbiol. Meth. 180: 106125. 2021. https://doi.org/j8vb.
[18] KURMANOV, B.; ZINCKE, D.; SU, W.; HADFIELD, T. L.; AIKIMBAYEV,
A.; KARIBAYEV, T.; BERDIKULOV, M.; ORYNBAYEV, M.; NIKOLICH,
M.P.; BLACKBURN, J.K. Assays for Identication and Differentiation
of Brucella Species: A Review. Microorganisms. 10(8): 1584. 2022..
https://doi.org/j8vc.
[19] LEAL-KLEVEZAS, D.S.; MARTÍNEZ-VÁZQUEZ, I.O.; LÓPEZ-MERINO,
A.; MARTÍNEZ-SORIANO, J.P. Single-step PCR for detection of
Brucella spp. from blood and milk of infected animals. J. Clin.
Microbiol. 33(12): 3087–3090. 1995. https://doi.org/j8vd.
[20] LEDWABAID, M.B.; GOMO, C.; LEKOTA, K.E.; LE FLÈCHE, P.;
HASSIM, A.; VERGNAUD, G.; VAN HEERDEN, H. Molecular
characterization of Brucella species from Zimbabwe.PLoS
Neglected Trop. Dis.13(5): e0007311. 2019. https://doi.org/gqrrp7.
[21] LÓPEZ-CALLEJA, I.; GONZÁLEZ, I.; FAJARDO, V.; RODRÍGUEZ,
M.A.; HERNÁNDEZ, P.E.; GARCÍA, T.; MARTÍN, R. Rapid detection
of cows' milk in sheeps' and goats' milk by a species-specic
polymerase chain reaction technique. J. Dairy Sci. 87(9): 2839-
2845. 2004. https://doi.org/fnqhxr.
[22] LUNA. L.; CHÁVEZ, G.; MEJÍA, L.; BARRAGÁN, V.; TRUEBA, G.
Molecular detection of Brucella species in Ecuador. Internat. J.
Appl. Res. Vet. Med. 14(2): 185–189. 2016. https://bit.ly/3LGAtc1.
20/12/2022.
[23] MAINATO, E.A.; RAMÓNEZ, J.C.; RAMÓNEZ, M.A.; GARAY, G.S.
Factores de riesgo que inuyen sobre la frecuencia de brucelosis
bovina en ganaderías de Azuay, Ecuador. Arch. Latinoame. Prod.
Anim. 30: 57–58. 2022. https://doi.org/j8vf.
[24] MANCILLA, M.; VILLARROEL, M.; SALDÍAS, M.E.; SOTO, J.;
ZÁRRAGA, A.M. Genotipos de aislados de campo de Brucella
abortus de distintas regiones geográcas de Chile. Arch. Med.
Vet. 40(2): 187–192. 2008. https://bit.ly/3M1W6oz. 20/12/2022.
[25] MOSQUERA, X.; BERNAL, C.; MUSKUS, C.; BERDUGO, J.
Detección de Brucella abortus por PCR en muestras de sangre
y leche de vacunos. Rev. MVZ. Cordova. 13(3): 1504–1513. 2008.
https://bit.ly/3nGWvmT.
[26] OGUGA, A.J.; AKINSEYE, V.O.; CADMUS, E.O.; JOLAOLUWA-
AWOSANYA, E.A.; ALABI, P.I.; IDOWU, O.S.; AKINADE, S.A.; DALE,
E.J.; PERRETT, L.; TAYLOR, A.; IGNOCIO, M.; CADMUS, S.I.B.
Prevalence and risk factors associated with bovine brucelosis
in herds under extensive production system in southwestern
Nigeria. Trop. Anim. Health Prod. 50(7): 1573–1582. 2018. https://
doi.org/gfdk62.
[27] OJEDA-GUTIERREZ, K.; ROMÁN-CÁRDENAS F. Identicación
molecular de Brucella spp. en muestras de sangre de ganado
bovino de la provincia de Zamora Chinchipe. Centro Biotecnol.
07: 11–16. 2018. https://bit.ly/44MJ6L0. 15/01/2023.
[28] O'LEARY, S.; SHEAHAN, M.; SWEENEY, T. Brucella abortus
detection by PCR assay in blood, milk and lymph tissue of
serologically positive cows. Res. Vet. Sci. 81(2): 170–176. 2006.
https://doi.org/dj6s4p.
[29] OUAHRANI-BETTACHE, S.; JIMÉNEZ DE B, M.P.; DE LA GARZA,
J.; FREDDI, L.; BUESO, J.P.; LYONNAIS, S.; AL DAHOUK, S.; DE
BIASE, D.; KÖHLER, S.; OCCHIALINI, A. Lethality of Brucella
microti in a murine model of infection depends on the wbkE
gene involved in O-polysaccharide synthesis. Virulence. 10(1):
868–878. 2019. https://doi.org/grkg3z.
[30] POULSEN, K.P.; HUTCHINS, F.T.; MCNULTY, C.M.; TREMBLAY, M.;
ZABALA, C.; BARRAGAN, V.; LOPEZ, L.; TRUEBA, G.; BETHEL,
J.W. Brucellosis in dairy cattle and goats in northern Ecuador.
The Amer. J. Trop. Med. Hyg. 90(4): 712–715. 2014. https://doi.
org/f5xmvd.
[31] RAGHAVA, S.; GOWDA, M.H.M.; SHOME, R.; KULKARNI, M.;
UMESHA, S. Epidemiological and molecular characterization
of Brucella species in cattle. Asian. J. Anim. Sci. 11(3): 123–131.
2017. https://doi.org/j8vg.
[32] RENTERÍA-EVANGELISTA, T.B.; ORGANES-DE LOS SANTOS,
H.; LICEA-NAVARRO, A.F.; MEDINA-BASULTO, G.E.; NIELSEN,
K.; MONTAÑO-GÓMEZ, M. F.; MORENO-ROSALES, J.F.; PUJOL-
MANRÍQUEZ, L.C. Evaluación de la prueba reacción en cadena de
Identificación molecular de Brucella en Ecuador / Andrade-Guzmán y col. _________________________________________________________
8 de 14
la polimerasa (PCR) a partir de muestras de leche y cultivos puros
en el diagnóstico de la brucelosis bovina. Téc. Pec. México. 43(1):
117–126. 2005. https://bit.ly/3NLbRkT. 03/01/2023.
[33] RODRIGUEZ-HIDALGO, R I.; CONTRERAS-ZAMORA, J.; BENITEZ-
ORTIZ, W.; GUERRERO-VIRACOCHA, K.; SALCAN-GUAMAN, H.;
MINDA, E.; RON-GARRIDO, L. Circulating strains of Brucella abortus
in cattle in Santo Domingo de los Tsachilas Province-Ecuador.
Front. Publ. Health. 3(45): 1–5. 2015. https://doi.org/j8vj.
[34] ROMÁN-CÁRDENAS, F.; LUNA-HERRERA, J. Revisión actualizada
de la epidemiología de Brucelosis (Brucella abortus, Brucella
mellitensis, Brucella suis, Brucella canis) en el Ecuador y el
mundo. Centro Biotecnol. 6: 82–93. 2017. https://bit.ly/3B7IstD.
[35] ROMAN-CARDENAS, F.; RAMÓN-CONTENTO, P. Identicación
molecular de Brucella abortus en nódulos linfáticos de bovinos
faenados en Loja. Siembra. 8 (1): 1–10. 2021. https://doi.org/j8vp.
[36] ROMERO, C.; LOPEZ-GOÑI, I. Improved method for purication of
bacterial DNA from bovine milk for detection of Brucella spp. by
PCR. Appl. Environm. Microbiol. 65(8): 3735–3737. 1999. https://
doi.org/j8vq.
[37] RON-ROMÁN, J.; BERKVENS, D.; BARZALLO-RIVADENEIRA, D.;
ANGULO-CRUZ, A.; GONZÁLEZ-ANDRADE, P.; MINDA-ALUISA,
E.; BENÍTEZ-ORTÍZ, W.; BRANDT, J.; RODRÍGUEZ-HIDALGO,
R.; SAEGERMAN, C. The unexpected discovery of Brucella
abortus Buck 19 vaccine in goats from Ecuador underlines the
importance of biosecurity measures. Trop. Anim. Health Prod.
49(3): 569–574. 2017. https://doi.org/f9x4hr.
[38] RON-ROMÁN, J.; RON-GARRIDO, L.; ABATIH, E.; CELI-ERAZO,
M.; VIZCAÍNO-ORDÓÑEZ, L.; CALVA-PACHECO, J.; GONZÁLEZ-
ANDRADE, P.; BERKVENS, D.; BENÍTEZ-ORTÍZ, W.; BRANDT, J.;
FRETIN, D.; SAEGERMAN, C. Human brucellosis in northwest
Ecuador: typifying Brucella spp., seroprevalence and associated
risk factors. Vector Borne Zoon. Dis. 14(2): 124–133. 2014. https://
doi.org/j8vs.
[39] SCHURIG, G.G.; ROOP, R.M.; BAGCHI, T.; BOYLE, S.; BUHRMAN,
D.; SRIRANGANATHAN, N. Biological properties of RB51; a stable
rough strain of Brucella abortus. Vet. Microbiol. 28(2): 171–188.
1991. https://doi.org/cpjcm8.
[40] SCHWENKER, J.A.; FRIEDRICHSEN, M.; WASCHINA, S.; BANG,
C.; FRANKE, A.; MAYER., R.; HÖLZEL, S. Bovine milk microbiota:
Evaluation of different DNA extraction protocols for challenging
samples. Microbiol. Open. 11(2): e1275. 2022. https://doi.org/j8vt.
[41] SUÁREZ-ESQUIVEL, M.; RUIZ-VILLALOBOS, N.; JIMÉNEZ-ROJAS,
C.; BARQUERO-CALVO, E.; CHACON-DIAZ, C.; VIQUE-RUIZ, E.;
ROJAS-CAMPOS, N.; BAKER, S. K.; OVIEDO-SANCHEZ, G.;
AMUY, E.; CHAVES-OLARTE, E.; THOMSON, N. R.; MORENO,
E.; GUZMAN-VERRI, C. Brucella neotomae Infection in Humans,
Costa Rica. Emerging Infectious Diseases. 23(6) 997–1000. 2017.
https://doi.org/gbhb6k.
[42] TORRES-HIGUERA, L.D.; JIMÉNEZ-VELÁSQUEZ, S.D.C.;
RODRÍGUEZ-BAUTISTA, J.L.; PATIÑO-BURBANO, R.E. Identication
of Brucella abortus biovar 4 of bovine origin in Colombia. Rev.
Argentina Microbiol. 51(3): 221–228. 2019. https://doi.org/j8vw.
[43] WURYASTUTY, H.; WASITO, R.; SUGIYONO. Molecular identication
of Brucella abortus collected from whole blood samples of
seronegative dairy cattle with reproductive disorders in Central
Java, Indonesia. Pakistan Vet. J. 39(3): 455–458. 2019. https://
doi.org/j8vx.