https://doi.org/10.52973/rcfcv-e33233
Recibido:28/01/2023 Aceptado: 28/03/2023 Publicado: 28/04/2023
1 de 7
Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, rcfcv-e33233, 1 - 7
RESUMEN
En la industria avícola, existen diferentes tipos de Escherichia coli
patógenos y no patógenos, según los genes asociados a virulencia
(VAG) presentes en la bacteria. Sin embargo, los reportes sobre la
identicación de los VAG de E. coli en pollos de engorde son limitados,
especialmente en comunidades andinas ecuatorianas. El objetivo
principal de este estudio consistió en identificar la diversidad
genética y la presencia de VAG en cepas de E. coli. Se caracterizaron
los VAG en varias granjas de la provincia del Azuay (sur del Ecuador)
a partir de 30 aislados de cultivos bacteriológicos provenientes de
pollos con signos clínicos de colibacilosis. Se utilizó la técnica de
PCR para detectar el gen uspA especíco de E. coli e igualmente los
VAG que incluyen adhesinas (mC), exotoxinas (cvaA) y sistemas de
captación-transporte de hierro (iucD; chuA; fyuA), en cada aislamiento
bacteriano. Se tipicaron molecularmente los E. coli patógenos
mediante la evaluación de las secuencias de politrinucleótidos (GTG)
5
.
El 83,33 % de los cultivos presentaron el gen uspA de E. coli. Las
frecuencias de VAG positivos fue de 48 % para el gen chuA, 20 % para
el gen cvaA, 84 % para el gen mC, 36 % para el gen fyuA y 56 % para
el gen iucD. La evaluación de las secuencias (GTG)
5
reveló dos grupos
logenéticos principales de E. coli, los cuales, en su mayoría portan
al menos un gen VAG. Estos resultados contribuyen a un diagnóstico
preciso de la colibacilosis, su control y tratamiento ecaz por parte
de los avicultores.
Palabras clave: Colibacilosis aviar; cultivos bacteriológicos;
politrinucleótidos (GTG)
5
; logenéticos; VAG
ABSTRACT
In the poultry industry there are different types of pathogenic
and non-pathogenic Escherichia coli, depending on the virulence
associated genes (VAG) present in the bacteria. However, there are
no reports for the area on the identication of E. coli VAG in broiler
chickens especially in Ecuadorian andean communities. The main
objective of this study was to identify the genetic diversity and the
presence of VAG in E. coli strains. In this study, E. coli VAG were
characterized in the Azuay Province (Ecuador) using isolates from
30 bacteriological cultures from chickens with clinical signs of
colibacillosis. The PCR technique was used to detect the uspA gene
(specic from E. coli) and also the GAV of adhesins (mC), exotoxins
(cvaA) and iron uptake-transport systems (iucD; chuA; fyuA) in
each bacteria isolate. Pathogenic E. coli were molecularly typed by
evaluating polytrinucleotide (GTG)
5
sequences. The 83.33 % of the
cultures presented the uspA gene from E. coli. The frequencies of
positive VAG were 48 % for the chuA gene, 20 % for the cvaA gene,
84 % for the mC gene, 36 % for the fyuA gene and 56 % for the iucD
gene. Sequence evaluation (GTG)
5
revealed two main phylogenetic
groups of E. coli most of which carried at least one VAG gene. These
results contribute to a more precise diagnosis of colibacillosis, as
well as to is control and treatment by poultry farmers.
Key words: Avian colibacillosis; bacteriological cultures;
politrinucleotides (GTG)
5
; phylogenetic; VAG
Determinación de la diversidad genética y caracterización de genes de
patogenicidad en aislados de Escherichia coli en pollos de engorde
(Gallus gallus domesticus), Azuay, Ecuador
Determination of genetic diversity and characterization of genes associated with virulence from
Escherichia coli isolates in poultry (Gallus gallus domesticus), Azuay, Ecuador
Fabián Manuel Astudillo-Riera
1
* , Kevin Fabian Astudillo-Vallejo
2
, Ana Cecilia Pérez-Pintado
1
, Antonio Javier Vallecillo
1
,
Sergio Emiro Rivera-Pirela
3
y Juan Patricio Pesántez-Vallejo
4
1
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Cuenca, Ecuador.
2
CEMEVET. Cuenca, Ecuador.
3
Universidad de Zulia, Facultad de Ciencias Veterinarias. Maracaibo, Venezuela.
4
Universidad de Cuenca, Departamento de Recursos Hídricos y Ciencias Ambientales. Cuenca, Ecuador.
*Autor correspondencia: fabian.astudillo@ucuenca.edu.ec
Diversidad genética y genes de patogenicidad en E. coli aviares / Astudillo-Riera y col. ____________________________________________
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INTRODUCCIÓN
En la industria avícola, la colibacilosis causada por la bacteria
Escherichia coli, es considerada la afección más frecuente en avicultura
causante de importantes pérdidas económicas [23], pudiéndose
presentar además como septicemia colibacilar [33, 34]. La gran
variedad de formas de presentación de la enfermedad se debe a las
distintas variantes antigénicas de E. coli patogénica aviar (APEC,
por sus siglas en inglés Avian Pathogenic Escherichia coli) dada la
diversidad de antígenos (O, K, H y F) que posee serotipos (O1; O2; O35
y O78) identicados, presentes en el 75 % de las cepas APEC [3, 18].
El daño potencial de las APEC depende de la expresión de genes
codicantes de factores de virulencia (VAG). Los VAG pueden codicar
adhesinas, diferentes toxinas, proteínas captadoras de hierro, que
constituyen factores de virulencia para varias especies animales
incluyendo los seres humanos [18, 31]. Las bacterias poseen medios
para jarse a un tejido, lo cual se denomina adherencia, necesitan captar
hierro para su crecimiento y pueden producir algunas toxinas cuando
captan concentraciones bajas de hierro [3]. Estos factores de virulencia
producen alta mortalidad característica de esta entidad nosológica.
Los VAG son diversos: astA (codica arginina succiniltransferasa
A), chuA (codica la proteína A de hemeutilización de E. coli), cvaA/B
(codifica colicina VA/B), fimC (codifica para fimbrias de unión
a manosa tipo 1), fyuA (codica proteínas para la captación A de
yersiniabactina férrica), irp2 (codica para proteínas de alto peso
molecular reprimibles con Hierro 2), aumento de la supervivencia
sérica (iss), sistemas de absorción de hierro de E. coli D (iucD),
pielonefritis asociada a pili C (papC), hemaglutinina sensible a la
temperatura (TSH) y toxina vacuolante autotransporter (IVA). De los
anteriores, los más prevalentes en las APEC son los genes mC,
cvaA, iucD; chuA, fyuA [6, 8, 27]. En general, para que un aislado
bacteriano sea considerado patógeno es necesaria la presencia de
al menos un factor de adhesión, uno de adquisición de hierro y otro
de resistencia sérica. [8]. Actualmente se han descrito alrededor de
23 tipos potencialmente patógenos de E. coli, identicados mediante
técnicas de Reacción en Cadena a la Polimerasa (PCR) [9, 10, 20], lo
cual, podría permitir desarrollar nuevas alternativas de tratamiento,
tomando en cuenta los VAG especícos [4, 7].
Para desarrollar estos diagnósticos moleculares adecuados de la
incidencia de variantes patógenas de E. coli en la industria aviar, se
requiere la identicación de marcadores moleculares adecuados.
En primer lugar, una prueba basada en la PCR para diferenciar E. coli
de otras bacterias Gram negativas emplea cebadores derivados de
las secuencias de nucleótidos que anquean el gen que codica la
proteína uspA y es altamente especíco para E. coli [5]. La proteína
uspA en E. coli K-12 ha sido identicada como una proteína de estrés
universal y su síntesis por la bacteria se induce en respuesta a un
gran número de fuentes de estrés [24]. En segundo lugar, para el
análisis de la diversidad genética de las diferentes cepas de E. coli
se ha determinado que el método (GTG)
5
-PCR posee mayor potencial
para la diferenciación de E. coli fecal aislada de humanos, aves de
corral y silvestres lo que lo hace el más adecuado para la tipicación
molecular de estas cepas [20].
En particular, en Ecuador se ha observado que los manejos
de las granjas avícolas no se ajustan a las mejores prácticas de
bioseguridad establecidas por los entes estatales reguladores [22].
Esto incrementa las probabilidades de proliferación de E. coli y que el
control de la misma por parte de los avicultores se vea comprometida,
aumentando incluso su resistencia a antibióticos por el uso empírico
de los mismos, subdosicaciones, empleo de antibióticos como
prolácticos [32].
En países altamente industrializados, esta patología puede llevar a
pérdidas millonarias, con impactos económicos altamente negativos
[25]. Hasta la presente fecha en Ecuador, la información se limita a
estudios que analizan la resistencia de la bacteria a antibióticos [22] o
su prevalencia [13], sin profundizar el estudio de los VAG y el potencial
patógeno de las cepas aisladas. El análisis de los VAG debe aportar
información valiosa al productor, que conlleve a un mejor control de la
colibacilosis aviar y proporcionar una mejoría en el bienestar animal [21].
El objetivo principal de este estudio consistió en identicar la
diversidad genética y la presencia VAG en cepas de E. coli aisladas de
casos de colibacilosis en pollos (Gallus gallus domesticus) de engorde
en la provincia del Azuay (Ecuador).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Se colectaron 50 muestras con hisopos estériles de exudados de
órganos de pollos de engorde con signos clínicos de colibacilosis aviar
como aerosaculitis, perihepatitis, pericarditis y sinovitis articular, de
granjas localizadas en la provincia del Azuay (Ecuador), transportadas
en medios apropiados como el Stuart, procesadas y almacenadas a
4
°
C en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad de Cuenca (Ecuador). Se trabajó
con 30 aislados de E. coli, identicados fenotípicamente en dicho
laboratorio; para ello se sembró por la técnica de agotamiento la
muestra en agar nutritivo, se caracterizó macroscópicamente las
muestras homogéneas de acuerdo a tamaño, color y forma: colonias
pequeñas, circulares, blanquecinas y de consistencia cremosa. Las
muestras también fueron sometidas a la Tinción de Gram.
Extracción de ADN de las cepas de E. coli
Cada aislado de E. coli se inoculó (50 microlitros –uL–) en 5 mililitros
–mL– de caldo nutritivo y fue incubado por 24 horas a 37°C. Finalizado
el periodo de incubación, se centrifugó los caldos con crecimiento
bacteriano, a 12.000 G por 20 minutos –min–) (Centrífuga Eppendorf 5430
R, Eppendorf, Alemania) en tubos de 1,5 mL, se eliminó el sobrenadante y
el sedimento (paquete celular) se mezcló con 175 μL de solución tampón
de lisis [5 mL de NaCl (1 M), 5 mL de Sucrosa (1 M), 5 mL de Tris (1 M), 2,5
mL de EDTA (1 M) y 2,5 mL de SDS (10 %)]. Se agregaron 3,5 μL de lisozima
y se incubó a 37°C por 60 min. Posteriormente, se añadieron 20 μL de
dodecilsulfato de sodio y 1 μL de proteinasa K, se incubó a 55°C por 90
min (Incubadora bacteriológica Selecta, 3000957, Selecta, España)
obteniéndose de esta manera la solución de lisado (SL). Para llevar a cabo,
propiamente, la extracción del Ácido desoxirribonucleico -ADN- total, a la
SL se le agregó el mismo volumen, de una solución de fenol, cloroformo
y alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó (Agitador Vortex TP – Laboratorio
México) y centrifugó a 14.000 G por 5 min a temperatura ambiente. Se
rescató el sobrenadante de la emulsión obtenida, se colocó en un nuevo
tubo, se añadió 2,5 volúmenes de etanol absoluto y centrifugó a 14.000
G por 5 min se eliminó el sobrenadante, se añadió 1 mL de etanol al 70 %
y se centrifugó a 14.000 G por 3 min. Se eliminó el sobrenadante y se
dejó secar en el fondo del tubo el sedimento con el ADN. Se le agregaron
entre 50 y 100 μL de agua ultra pura, desionizada, para aplicaciones
en biología molecular y se obtuvo el ADN total (ADNt) y se almacenó a
–20°C (Congelador Indurama, Dos P, Indurama, Ecuador) hasta su uso.
FIGURA 1. Análisis a través de electroforesis en gel agarosa de
los productos amplicados por PCR de los genes uspA, chuA, cvaA,
mC, fyuA y iucD. con un marcador de peso molecular (M: 100bp
DNA Ladder, Invitrogen, N°. Cat. 15628050)
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Ensayo de PCR para la detección del gen uspA de E. coli
Se realizó un ensayo de PCR para la detección del gen uspA con
el n de conrmar molecularmente la identicación de E. coli. Se
preparó la mezcla de reacción para la PCR con 19,25 μL de agua ultra
pura, desionizada, 2,5 μL de solución tampón (10X) para PCR, [200
milímetros –mm– de Tris HCl (con un pH de 8,4) y 500 milimolar –mM–
de KCl, 0,25 μL de 10 mM dNTP´s c/u, 1 μL de 50 mM MgCl
2
, 0,2 μL de
100 micromolar –μM– Oligo uspA–For: 5’-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3’,
0,2 μL (100 μM) Oligo uspA–Rev: 5’-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3’ [5],
0,2 μL de enzima Taq DNA polimerasa de 5 unidades por microlitros
(U·μL
-1
) y, 2 μL de muestra de ADN, 25 nanogramos por microlitro
(ng·μL
-1
) para un volumen total de 25,6 μL [25].
La mezcla se homogenizó en un vórtex por 4-6 segundos (seg)
y luego se centrifugó a 14.000 G por 15-20 seg. Los tubos con las
mezclas de reacción correspondiente a cada muestra se colocaron en
un termociclador Eppendorf (Modelo: Nexus GSX1) y fueron sometidos
al siguiente perl de temperatura: desnaturalización inicial 94°C por
4 min, 35 ciclos de: desnaturalización por 30 seg a 94°C, alineamiento
por 25 seg a 65°C, extensión por 45 seg a 72°C y extensión nal por 5
min a 72°C. Los productos de las reacciones de PCR se resolvieron
en un gel de agarosa-TAE al 1,2 % teñido con bromuro de etidio,
entre 20 a 100 voltios –V– Para la detección del gen uspA de E. coli
la visualización en el fotodocumentador (Bio Rad, Modelo: Gel Doc
XR+, EUA) de un producto de PCR de aproximadamente 884 pares
de bases –pb– se consideró positivo (FIG. 1) [25]. Se utilizó como
control positivo material genético de la cepa E. coli Top10F´ y agua
como control negativo.
Detección de genes codicantes de factores de virulencia de E. coli
Con los ADN positivos de los cultivos al gen uspA de E. coli se realizó
un nuevo ensayo de PCR para identificar los genes de virulencia
existentes en las cepas aisladas. Se buscaron cinco genes codicantes
de factores de virulencia: mC (adhesinas), cvaA (exotoxinas) y iucD,
chuA y fyuA (proteínas del sistema de captación-transporte de hierro).
Se preparó la mezcla de PCR según la descripción en el apartado
anterior, más los oligonucleótidos para cada mezcla de acuerdo al gen
que se desee realizar la técnica de PCR. Los cebadores incorporados
para cada mezcla se detallan en la TABLA I.
La mezcla se homogenizó en un vórtex por 10 seg y luego se
centrifugó en una nanocentrífuga para colectar el contenido de la
mezcla de los tubos con las mezclas a amplicar, se colocaron en el
termociclador (Eppendorf Modelo: Nexus GSX1, Bio Lab, España) y
fueron sometidos al perl de temperatura presentados en la TABLAII,
de acuerdo a las necesidades de cada reacción.
Los productos de las reacciones de PCR se resolvieron en un gel
de agarosa-TAE al 1 % teñido con bromuro de etidio (0,3 μg·mL
-1
).
La visualización de las bandas electroforéticas producto de la
amplicación PCR, cuyos tamaños (pb) esperados están indicadas
en la TABLA I, fueron consideradas como presencia del gen que
codican para factores de virulencia de E. coli, usando un marcador
de peso molecular con catálogo número 15628050 (FIG. 1).
TABLA I
CEBADORES EMPLEADOS PARA DETECTAR LA SECUENCIA DE LOS CINCO
GENES PORTADORES DE FACTORES DE VIRULENCIA PARA E. coli
Gen Cebador (5’–3’) F1/R2*
Tamaño del producto
PCR (pb)**
Genes Codicados Referencia
iucD
F: ACAAAAAGTTCTATCGCTTCC
714 Transporte de hierro
Ewers y col. (2005)
R: CCTGATCCAGATGATGCTC
cvaA
F: GGTAGAATGTGCCAGAGCAAG
1181 Exotoxinas
R: GAGCTGTTTGTAGCGAAGCC
chuA
F:GACGAACCAACGGTCAGGAT
279 Transporte de hierro Saiki y col. (1987)
R:TGCCGCCAGTACCAAAGACA
mC
F:GGGTAGAAAATGCCGATGGTG
497 Adhesinas
Ozaki y col. (2004)
R:CGTCATTTTGGGGGTAAGTGC
fyuA
F:GCGACGGGGAAGCGATGACTTA
774 Transporte de hierro
R:CGCAGTAGGCACGATGTTGTA
* F: forward, R: reverse. **pb: pares de bases
Diversidad genética y genes de patogenicidad en E. coli aviares / Astudillo-Riera y col. ____________________________________________
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Evaluación de la diversidad genética de los aislados de E. coli
Con los ADN de E. coli, se realizó un nuevo ensayo de (GTG)
5
-PCR para
determinar la diversidad de cepas existentes en los cultivos recolectados,
mediante la localización de la secuencia politrinucleótidica (GTG)
5
.
Se preparó una mezcla, con las siguientes características: 19,25 μL
agua ultra pura desionizada, 2,5 μL (10X) de tampón de PCR, 0,5 μL de
dNTP’s [10 mM c/u], 1,5 μL de MgCl
2
(50 mM), 0,5 μL de Oligo (GTG)
5
:
5’-GTG GTG GTG-3’ (100 µM), 0,25 μL de enzima Taq DNA polimerasa
(5 U·μL
-1
) y 2 μL de muestra de ADN (25 ng·μL
-1
) para un volumen total
de 25 μL. La mezcla se homogenizó en un vórtex por 10 seg y luego
se centrifugó a 12.000 G por 10 min.
Los tubos con las muestras a amplificar, se colocaron en el
termociclador y fueron sometidos al siguiente perl de temperatura:
desnaturalización inicial 95°C por 2 min, 35 ciclos de desnaturalización
por 3 min 30 seg a 92–94°C, alineamiento por 60 seg a 40°C extensión
por 8 min a 65°C y extensión nal por 8 min a 65°C.
Los productos de las reacciones de PCR se resolvieron mediante
electroforesis en un gel de agarosa-TAE al 1,5 % teñido con bromuro
de etidio (0,3 μg·mL
-1
), entre 20 a 100 V, acompañado con una cepa
de vacuna comercial como control. La visualización del producto de
PCR fue fotodocumentada y las localizaciones de cada banda (pb)
fueron consideradas como expresión de diversidad de las cepas
de E. coli. evaluadas. El dendograma de (GTG)
5
-PCR de cepas de E.
coli se realizó mediante el método UPGMA (Unweighted Pair-group
Method with Arithmetic) del programa PyElph (sistema de aplicación
de software para análisis de imágenes de gel y logenética con la
técnica (GTG)
5
[21, 31].
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En 25 de los 30 aislamientos (83.33 %) se observó la banda
electroforética correspondiente a la detección del gen uspA exclusivo
de la bacteria E. coli, signica que la caracterización fenotípica puede
conllevar a la identicación de falsos positivos para E. coli. De los
factores de virulencia (VAG) objeto de estudio, TABLA III, el gen mC,
relacionado con la capacidad de adherencia de la bacteria, se visualizó
en el 84 % de los aislamientos (21/25), en concordancia con Kvint y
col. [16], quienes encontraron que el gen mC constituye el perl
más común que caracteriza a APEC. Los genes relacionados con la
adquisición de hierro se encontraron en los siguientes porcentajes
iucD 56 % (14/25), chuA 48 % (12/25), fyuA 36 % (9/25), en contra
posición a la mayor prevalencia reportada por Márquez-Quiroz y
col. [18] con un 95.6 % presentes en más del 60 % de APEC, y el gen
cvaA, con una presencia del 20 % (5/25), mientras que De Carli y col.
[8] detectaron en aislamientos de E. coli un 42 % del mismo gen.
El análisis de diversidad genética (GTG)
5
reveló que existen 2 grupos
logenéticos principales (FIG. 2), los cuales en su mayoría tienen al
menos un VAG, También se determinó la relación logenética existente
entre los VAG de las cepas de E. coli como lo demuestra la FIG. 3.
Este estudio indica que los aislados de E. coli de casos de
colibacilosis en pollos de engorde en la Provincia de Azuay (Ecuador)
TABLA II
PERFILES DE TIEMPO Y TEMPERATURA USADOS EN LA AMPLIFICACIÓN DE
LOS CINCO GENES ASOCIADOS A VIRULENCIA DE E. coli
Etapas y Genes
Desnaturalización
Inicial
25 ciclos
Extensión
Final
Desnaturalización Alineamiento Extensión
Gen iucD
Temperatura
94°C 94°C 59,4°C 72°C 72°C
Tiempo
4 min 30 seg 25 seg 45 seg 5 min
Gen cvaA
Temperatura
94°C 94°C 60,6°C 72°C 72°C
Tiempo
4 min 40 seg 25 seg 50 seg 5 min
Gen chuA
Temperatura
94°C 94°C 65°C 72°C 72°C
Tiempo
4 min 30 seg 25 seg 30 seg 5 min
Gen mC
Temperatura
94°C 94°C 60,6°C 72°C 72°C
Tiempo
4 min 30 seg 20 seg 30 seg 5 min
Gen fyuA
Temperatura
94°C 94°C 60,6°C 72°C 72°C
Tiempo
4 min 30 seg 25 seg 45 seg 5 min
TABLA III
RESULTADOS DEL GEN uspA Y VAG EN LOS CULTIVOS
MICROBIOLÓGICOS POSITIVOS A E. coli
Genes uspA chuA cvaA mC fyuA iucD
Positivos
25
(83,33 %)
12
(48 %)
5
(20 %)
21
(84 %)
9
(36 %)
14
(56 %)
FIGURA 2. Dendrograma de (GTG)
5
-PCR de las 25 cepas de E. coli
estudiadas en función de su similitud en el patrón de bandas (GTG)
5
.
Se observan dos grupos genéticos, 1 y 2, identicados con barras
verticales. A la derecha se indica para cada cepa la presencia de
cada factor de virulencia, mediante un rectángulo negro
FIGURA 3. Dendrograma de (GTG)
5
–PCR demostrando la relación
logenética de los VAG
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Mediante la técnica de PCR se detectó además el gen fimC,
relacionado con la capacidad de adherencia de la E. coli, el cual estuvo
presente con el mayor porcentaje de los aislamientos positivos de este
estudio. Estos resultados se correlacionan con otras evaluaciones
genotípicas de los VAG de E. coli patógena en pollos de engorde, que
también identican el gen mC como el más frecuente [27].
La presencia de uno o más genes iucD, chuA, fyuA relacionados
con los sistemas de captación y transporte de hierro del medio
celular, podría anular la presencia de APEC en diferentes condiciones
ambientales. Esto debido a que la capacidad de sobrevivir y crecer
en suero, en el cual el hierro es muy bajo parece ser un factor
determinante en la patogénesis de la colibacilosis [25, 33].
La mayoría de los estudios de seguimiento de la fuente microbiana
(MST) para la identicación de la procedencia de los aislados de
E. coli han utilizado los cebadores rep-PCR junto con el cebador
(GTG)
5
[(GTG)
5
-PCR] producen patrones de huellas genéticas más
discriminativas y complejos que los cebadores REP, ERIC y BOX A1R
durante la tipicación molecular de las especies de Enterococcus
[30], Lactobacillus [11] y Salmonella [28]. Se reportó que el índice
de discriminación de Simpson para E. coli [14] fue más alto (93,68 %)
con (GTG)
5
-PCR, seguido de BOX-PCR (91,23 %), REP-PCR (89,33 %),
ERIC-PCR (84,69 %) y ERIC2-PCR (79,38 %) y que, la (GTG)
5
-PCR produjo
números de banda de 10 a 25 [20]. Se conrma la mayor precisión
de (GTG)
5
-PCR, en comparación con BOX-PCR [15]. También hay que
resaltar el método de diagnóstico como es el uso de sondas para la
hibridación en fase sólidas, estas sondas son fragmentos pequeños
de ADN que contienen parte de los genes que codican para algún
factor de virulencia [29].
El análisis de conglomerados basado en el coeciente de similitud
de Pearson con las huellas genéticas de ADN (GTG)
5
-PCR de aislados
de E. coli fecal de aves de corral y aves de vida libre después de la
exclusión de los aislados clonales mostró un dendograma agrupando
417 aislamientos en dos grupos principales que separan los aislamientos
del grupo de aves de corral (pollo, pato y pavo) de los aislamientos del
grupo de aves silvestres (ganso, gaviota, halcón, urraca y pájaro cantor).
Un grupo denido con un nivel de similitud > 80 % podría producir una
buena diferenciación entre las fuentes de hospedadores [19, 26].
En un estudio realizado por Mohapatra y col. [18] para comparar
diferentes técnicas para la diferenciación de E. coli en humanos, aves
y cerdos (Sus scrofa domesticus), concluyeron que la mejor técnica
para realizar esta diferenciación era (GTG)
5
, seguida por otros métodos
de detección molecular. Adicionalmente, los autores concluyeron
que esta técnica es prometedora para ser usada en la vigilancia de
la contaminación fecal con E. coli, como herramienta diagnóstica de
enfermedades en la salud pública, gracias a la capacidad de revelar
la diversidad genética [19].
El análisis (GTG)
5
-PCR de este grupo de 25 aislamientos de E. coli
en pollos de carne con signología de colibacilosis, reveló la existencia
de dos grupos logenéticos principales, los cuales en su mayoría
tienen al menos un gen VAG, pudiendo tener su origen en diferentes
hospedadores principalmente pollos de corral y aves silvestres.
CONCLUSIONES
La presencia de secuencias del gen uspA y de los VAG en los cultivos
de hisopados provenientes de pollos de engorde con signología
característica de colibacilosis, en granjas avícolas de Azuay, Ecuador,
conrman la presencia de E. coli patógena.
tuvieron un alto grado de patogenicidad con características de
bacterias APEC. Existe una relación entre los serotipos y la virulencia
que expresan, unos presentan todos los VAG, otros dos o tres, incluso
algunos no maniestan su presencia. Los tratamientos actuales
en la región, están basados en su mayoría en el diagnóstico de
infección por E. coli mediante la detección de serotipos y cultivos,
lo cual está desaconsejado, ya que son pruebas poco sensibles y
especícas [1, 2, 12, 16, 17, 27]. En este estudio, el uso de la técnica
de PCR podría suponer una mejora sustancial en el diagnóstico, pues
permitió identicar con éxito la presencia del gen uspA exclusivo de
la bacteria E. coli.
Diversidad genética y genes de patogenicidad en E. coli aviares / Astudillo-Riera y col. ____________________________________________
6 de 7
Se diferenciaron dos grupos logenéticos con una distribución
heterogénea de cinco de los genes que codican los VAG en cultivos
de E. coli. de los aislados, en función de su similitud de bandas (GTG)
5
,
correspondientes probablemente a cepas bacterianas de orígenes
distintos, procedentes de aves silvestres u otros reservorios de la
bacteria.
AGRADECIMIENTOS
La identicación molecular de E. coli patógenas se realizó gracias al
apoyo del laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad de Cuenca, Ecuador.
Conictos de intereses
No existen conictos de intereses.
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