https://doi.org/10.52973/rcfcv-e33211
Recibido: 17/11/2022 Aceptado: 19/12/2022 Publicado: 21/02/2023
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Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIII, rcfcv-e33211, 1 - 9
RESUMEN
La Escherichia coli patógena extraintestinal, denominada E. coli
patógena aviar, posee atributos de virulencia específicos que
causan infecciones invasivas en aves de corral, responsables de la
Colibacilosis aviar. Los veterinarios tienen opciones restringidas de
agentes antimicrobianos para su tratamiento, debido a problemas de
resistencia bacteriana de la E. coli, que incide indirectamente en la
salud humana. Como alternativa se plantea el uso de bacteriófagos
con poder bacteriolítico especíco contra bacterias enteropatógenas.
El objetivo de este estudio fue el de caracterizar bacteriófagos líticos
especícos para E. coli (colifagos) como una alternativa de biocontrol
contra la colibacilosis aviar, determinando su especicidad frente
a E. coli enteropatógenas aisladas de la zona, su capacidad lítica,
fenotipo y genotipo. Para ello se recolectaron muestras ambientales
de plantas beneciadoras avícolas y de aguas residuales en granjas de
producción con problemas de colibacilosis. Se procedió al aislamiento
de bacteriófagos con actividad lítica aparente frente a E. coli TOP10F´ y
sobre los aislados de E. coli patógenas previamente caracterizadas de
la zona. Un total de 36 aislados de colifagos líticos fueron enfrentados
a 10 cepas patógenas de E. coli. De éstos, 22 fagos afectaron entre
el 10–50 % de las cepas evaluadas, 5 fagos infectaron entre el 60 y
70 % y solo 9 fagos no mostraron capacidad lítica frente a las cepas
patógenas de E. coli. Los fagos con capacidad lítica más alta fueron
seleccionados y caracterizados genotípicamente mediante la técnica
de fragmentos de restricción de longitud polimórca (RFLP), posterior
a su tratamiento con enzimas de restricción: BamHI, EcoRI, EcoRV
y Hind III. Como resultado se obtuvieron 4 colifagos con diferentes
patrones de banda. Se concluye que, en muestras ambientales de
granjas avícolas diagnosticadas de colibacilosis, se pueden aislar
una gran variedad de colifagos con potencial lítico para el biocontrol
de E. coli patógena.
Palabras clave: Colifagos; biocontrol; RFLP; E. coli; resistencia
ABSTRACT
Extraintestinal pathogenic Escherichia coli, termed E. coli avian
pathogenic possess specic virulence attributes causing invasive
infections in poultry, namely Colibacillosis. Veterinarians have limited
options of antimicrobial agents for its treatment, due to problems
of bacterial resistance of E. coli that indirectly affects human
health. As an alternative, the use of bacteriophages with specic
bacteriolytic power against enteropathogenic bacteria is proposed.
The objective of this study was to characterize lytic bacteriophages
specic for E. coli (coliphages) as a biocontrol alternative against avian
Colibacillosis, determining their specicity against enteropathogenic
E. coli isolated from the area, their lytic capacity, phenotype and
genotype. For this, semi-solid environmental samples were collected
from poultry slaughterhouses and from wastewater in production
farms. With the samples, it was proceeded to isolate the plaques
formed by the bacteriophages with the best apparent lytic activity
against E. coli TOP10F' and on the previously characterized pathogenic
E. coli isolates. A total of 36 coliphage isolates were tested against 10
pathogenic strains of E. coli. Of these, 22 phages affected between
10–50 % of the strains evaluated, 5 phages infected between 60
and 70 % and only 9 phages did not show lytic capacity against
pathogenic E. coli strains. The phages with the highest lytic capacity
were selected and genotypically characterized by the Restriction
Fragment Length Polymorphism (RFLP) technique, after treatment
with restriction enzymes: BamHI, EcoRI, EcoRV and Hind III. As a
result, 4 coliphages with different band patterns were obtained. It is
concluded that a wide variety of coliphages with lytic potential for the
biocontrol of pathogenic E. coli can be isolated from environmental
samples of poultry farms diagnosed with Colibacillosis.
Key words: Coliphages; biocontrol; RFLP; E. coli; resistance
Caracterización fenotípica y molecular de colifagos de granjas de pollos
de engorde con Colibacilosis y plantas beneciadoras de aves en Azuay,
Ecuador
Phenotypic and molecular characterization of colifages from broiler farms with Colibacilosis and
poultry processing plants from Azuay, Ecuador
Fabián Astudillo-Riera
1,3
* , Kevin Astudillo-Vallejo
1
, Maria Laura Gómez-Asanza
1
, Luis Armando Pacha-Aguilar
1
,
Antonio Javier Vallecillo-Maza
1,2
y Sergio Emiro Rivera-Pirela
3
1
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Cuenca, Ecuador.
2
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Laboratorio de Biología Molecular. Cuenca, Ecuador.
3
Universidad de Zulia, Facultad de Ciencias Veterinarias. Maracaibo, Venezuela.
*Correo electrónico: fabian.astudillo@ucuenca.edu.ec
Identificación de virus colifagos en granjas de pollos de engorde en Azuay / Astudillo-Riera y col. ________________________________
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INTRODUCCION
La Escherichia coli (E. coli) patógena aviar es un subgrupo de E. coli-
extraintestinal que ingresa a través de diferentes vías, incluidas las vías
genital y respiratoria, y causa varias enfermedades extraintestinales
conocidas colectivamente como Colibacilosis, responsables de grandes
pérdidas económicas en la industria avícola [25]. Las E. coli patógenas
aviares pertenecen principalmente a los serotipos O1, O2 y O78, cuando
son tipicables y representan un riesgo zoonótico potencial para los
seres humanos [21, 28]. El tratamiento de enfermedades causadas
por E. coli generalmente requiere terapia antimicrobiana. La decisión
de utilizar terapia antimicrobiana se basa en la susceptibilidad del
microorganismo y la farmacocinética del fármaco para obtener la
concentración terapéutica requerida en el sitio de la infección y por
lo tanto, la ecacia clínica [27]. Los veterinarios tienen un número
limitado de agentes antimicrobianos para ser usados en la industria
avícola, debido a problemas de resistencia a múltiples fármacos y el
peligro que representan para la salud humana. El uso indiscriminado
de los antimicrobianos condujo a un aumento de la tasa de resistencia
a los antibióticos [41], especialmente en los países subdesarrollados
y en desarrollo, donde los antibióticos se utilizan sin control para la
prolaxis y el tratamiento de enfermedades humanas y animales [42].
E. coli presente, tanto en humanos como en animales, posee resistencia
a varias clases de antibióticos, como aminoglucósidos, penicilina,
estreptomicina, cefalosporinas, sulfonamidas, tetraciclina y quinolonas
[21, 24]. Muchas cepas y genes resistentes a los medicamentos pueden
transmitirse y diseminarse entre patógenos animales y humanos [6].
Mucho antes del descubrimiento y uso de nuevos antibióticos,
se había sugerido la prevención y/o tratamiento de infecciones
bacterianas con la administración de bacteriófagos o llamados
también fagos [39]. Felix d'Herelle, un microbiólogo franco-canadiense
del Instituto Pasteur en 1917, observó la aparición de pequeñas áreas
claras contra Vibrio cholerae, que nalmente denomino placas [7].
El nombre “bacteriofago” fue propuesto por d'Herelle en 1917. En la
década de 1940, Eli Lilly Company (Indianapolis, Ind.) USA, produjo
siete productos de fagos para uso humano, incluidas preparaciones
dirigidas contra estalococos, estreptococos, Escherichia coli y
otros patógenos bacterianos [9]. La ecacia de las preparaciones
de fagos fue controvertida, y con la llegada de los antibióticos, la
producción comercial de fagos terapéuticos cesó en la mayor parte
del mundo occidental. Sin embargo, los fagos continuaron usándose
terapéuticamente, junto con o en lugar de antibióticos, en Europa
del Este y en la antigua Unión Soviética [44].
Los Fagos están constituidos por una cubierta proteica o cápside
en cuyo interior se encuentra el material genético que puede ser
ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Desde
que se observó actividad bactericida de los fagos en 1896, el uso de
bacteriófagos ha sido un foco de investigación dado que promete
ser una técnica que aborda varias deciencias a un costo muy bajo
[22]. El biocontrol con el uso de fagos se acepta cada vez más como
una técnica natural y ecológica, ecaz para atacar especícamente
patógenos bacterianos [40]. En la década de 1930 se aislaron los
primeros colifagos por Rakieten [22, 36]. En 1980, la inactivación
fágica de E. coli en ratones (Mus musculus) demostró la ecacia de
esta técnica comparada con el uso de antibióticos y a partir de este
éxito, entre otros, la exploración del uso de fagos como agentes de
biocontrol se convirtió en una modalidad atractiva para mejorar la
seguridad alimentaria en sustitución de antibióticos generadores
de resistencia bacteriana [18, 22, 40, 43]. Los virus bacteriófagos
son microorganismos que han sido presentados como candidatos
para una aplicación terapéutica frente a bacterias enteropatógenas.
Éstos pueden aislarse de muestras fecales, aguas residuales y ríos
contaminados [11, 26, 39].
Igualmente, tienen la capacidad de invadir y alterar el metabolismo de
dichos microorganismos, siendo especícos para un hospedador [30].
Los fagos se pueden dividir en virulentos y temperados en función
de su ciclo de vida. Los virulentos producen el ciclo lítico usado
preferiblemente para eliminar las bacterias patógenas. Los fagos
se unen a la supercie de la célula bacteriana, inyectan su genoma,
se reproducen gracias a la maquinaria molecular del hospedador y
como resultado se producen nuevas partículas fágicas que rompen
la pared celular liberando a los fagos de la progenie y matando al
antrión. Aunque dentro de sus capacidades está el multiplicarse
rápidamente, sin generar daño colateral sobre animales, plantas o
el ambiente [17].
Smith y col. estudiaron sobre el uso de fagos en Medicina Veterinaria
en 1982 y 1987 [35, 36]. En un primer trabajo informaron sobre el uso
exitoso de colifagos como tratamiento de infecciones experimentales
de E. coli en ratones; posteriormente, demostraron cómo la aplicación
de una dosis única de fago especíco para E. coli, redujo el número
de bacterias en el tracto digestivo de terneros (Bos taurus), corderos
(Ovis orientalis aries) y lechones (Sus scrofa domestica) infectados,
con diarrea causada por una cepa de E. coli. Adicional a esto, el
tratamiento disminuyó la pérdida de líquido causada por la misma
patología [39, 40].
Los colifagos son virus especícos para bacterias como E. coli,
los cuales secuestran el mecanismo metabólico de las mismas
para replicarse [15]. Según su ciclo de vida o tipo de infección, los
fagos pueden causar una infección lítica (fago virulento) o lisogénica
(fago leve). El primero por lo general produce la inoculación de su
material genético en el hospedador, en este caso en la bacteria,
induciendo variaciones de la estructura proteica del hospedador lo
que va a terminar con la lisis bacteriana y la liberación de fagos en una
cantidad que va desde 50 a 200 [29]. El tipo de infección lisogénica
resulta en la recombinación del genoma del fago con el de la bacteria,
aunque también puede existir como un plásmido. Este material
genético unido a la célula se heredará por varias generaciones de
la bacteria sin variaciones signicativas en su metabolismo. En
algunos casos, los bacteriófagos pueden modicar su ciclo de vida
cambiando de lisogénicos a líticos, especialmente cuando el número
de hospedadores ha disminuido [32].
Recientemente, modelos animales bien controlados han demostrado
que los fagos pueden librar animales; pollos (Gallus gallus domesticus),
ratones (Mus musculus), terneros, cerdos, corderos, peces (osteictios),
entre otros, de una gran variedad de infecciones dañinas causadas por
E. coli o Salmonella spp. [3, 4, 5, 19, 20, 23, 34, 38, 39, 40].
Oliveira y col. [31] utilizaron exitosamente la técnica de fragmentos
de restricción de longitud polimórfica (RFLP) para caracterizar
molecularmente bacteriófagos. Las diferencias entre los fagos se
confirmaron mediante la comparación entre los patrones RFLP
individuales [8]. Igualmente, evaluaron su desempeño lítico frente a
cepas de E. coli patógenas aviares con altos patrones de resistencia a
antibióticos, con el n de seleccionar fagos como producto terapéutico
para tratar la colibacilosis en pollos (Gallus gallus domesticus) [2].
Esta investigación tuvo por objetivo el aislamiento, determinación
de la capacidad lítica y la caracterización molecular de los colifagos
obtenidos a partir de muestras de plantas beneciadoras avícolas
FIGURA 1. Placa de Colifagos líticos: 4.4.2 = nula (0); 4.10.1 = baja
(1); 4.4.1 = media (2); 4.7.2 = moderada (3); 4.8.1 y 4.3.1 = alta (4)
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y granjas de producción de pollos de engorde, con historia de
colibacilosis, ubicadas en la provincia del Azuay, Ecuador.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo
Las muestras para este estudio fueron recogidas de aguas
residuales de plantas beneciadoras de aves y muestras semisólidas
de zonas donde había crianza de pollos de engorde con problemas de
colibacilosis. Se obtuvieron 36 muestras ambientales procedentes
de aguas estancadas, acequias, cama del galpón, plumas y vísceras
dentro del perímetro de la provincia del Azuay. Estas muestras
tuvieron un volumen superior a 5 mililitros (mL) (muestras líquidas)
y 10 gramos (g) (muestras sólidas), se colocaron en tubos estériles y se
transportaron en una hielera con refrigerante para posteriormente ser
procesadas todo el mismo día, en el laboratorio de Biología Molecular
de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca.
Aislamiento y enriquecimiento de bacteriófagos de las muestras
ambientales
Para el enriquecimiento, las muestras de aguas residuales (5 mL) se
centrifugaron a 14.000 × G (Centrífuga Eppendorf 5430 R, Eppendorf,
Alemania), durante 10 minutos (min), para separar las partículas de gran
tamaño. Las muestras ambientales sólidas (10 g) se mezclaron con 10mL
de solución salina antes de la centrifugación, se tomaron 1,8mL de la
muestra recogida, previamente homogenizada en el vórtex (Agitador
Vortex TP – Laboratorio, México) y se colocaron en tubos Eppendorf y se
centrifugaron a 14.000 × G por 10 min a temperatura ambiente. Se tomó
1 mL del sobrenadante resultante y se esterilizó por ltración utilizando
ltros de membrana de baja unión a proteínas de 0,22 micrómetros (μm)
(Filtros de jeringa; PVDF; 0,22 μm de diámetro; estéril; EUA).
Para tener un cultivo de E. coli TOP10F´ (Invitrogen™ E. coli
químicamente competente One Shot™ TOP10F´) se sembró en LB agar
(Medio de cultivo Luria Bertani; Triptona 1 %, extracto de levadura 0,5 %
y cloruro de Sodio 1 %) y se dejó incubar a 37 °C toda la noche. Con
puntas estériles de micropipetas se tomaron cada una de las placas
formadas por cada muestra ambiental ensayada. A esta punta se la
introdujo en 5 mL de cultivo LB y se colocaron 500 microlitros (µL) de
E. coli TOP10F´ y se sembraron en 5 mL LB líquido. Se incubó toda la
noche a 37 °C en estado estático.
El ltrado resultante (0,5 mL) se mezcló con 0,5 mL de cultivo de
E. coli TOP10F´ y luego se le adicionaron 5 mL de medio de cultivo LB
líquido. La mezcla fue incubada con una agitación de 200 revoluciones
por minutos (rpm) a 37 °C toda la noche (Agitador magnético Corning,
PC620D, Corning, México). De este cultivo se tomaron 1,8 mL y se
colocaron en la centrifuga refrigerada a 14.000 × G por 10 min a 4 °C,
luego se recuperaron 1,2 mL del sobrenadante, el cual almacenó en
tubos Eppendorf de 1.5 mL a 4 °C.
Evaluación de la actividad lítica sobre cepas de E. coli TOP10F´ y
los aislados de E. coli patógenas.
Se colocaron 30 mL de agar nutritivo (Peptona 0.5 %, extracto de
carne 0.3 % y agar 0.7 %) en el fondo de las cajas Petri. Se sembraron
10 cepas de E. coli del biobanco del laboratorio de Biología Molecular
de la Facultad de C.C. A.A. previamente aisladas de casos clínicos
en aves cultivadas en agar nutritivo [35] y, adicionalmente E. coli
TOP10F´ en medio LB. En un tubo de ensayo se colocaron 500 μL de
cultivo de E. coli más 5 μL de la última solución con fagos, se dejaron
reposar durante 5 min a temperatura ambiente. Se dividió en un
número determinado de cuadrantes cada caja Petri, uno por cada
cepa de E. coli (se utilizaron 36 cuadrantes), en cada uno de los cuales
se colocaron 2 µL de la mezcla E. coli con los diferentes aislados de
fagos. Se colocaron 3 mL de agar de cubierta, incubado a 45 °C, para
mantenerlo en estado líquido (Incubadora bacteriológica Selecta,
3000957, Selecta, España), en la supercie de la placa luego de la
siembra y se dejó incubar a 37 °C toda la noche en aerobiosis. El fago al
corresponder a la bacteria, se replica dentro de ella, observándose un
halo transparente de lisis en la caja (prueba de manchas) [1, 2, 3], Al día
siguiente se vericó, identicando las placas Petri aquellas manchas
que tuvieron un color más claro, que tendieran a la transparencia,
señal que indicaría si hubo o no actividad lítica por parte de los fagos
contra la E. coli.
Una vez identicadas en el cultivo con la cepa E. coli TOP10F´, las
muestras que contenían colifagos, se procedió a vericar para el
resto de las cepas de E. coli, las placas formadas en cada una de las
muestras, seleccionando aquellas que mostraron mayor actividad
lítica (bordes denidos y transparencia). Donde se mostraron muy
aglomeradas se realizaron diluciones seriadas hasta lograr una
concentración mínima de títulos capaz de provocar lisis de las
bacterias. De esa manera se obtuvieron placas o clonas virales
distinguibles con facilidad para la posterior amplicación individual de
cada fago. La capacidad lítica se clasicó de acuerdo a una valoración
numérica especulativa: en nula (0), baja (1), media (2), moderada (3)
y alta (4) [22] (FIG. 1).
Para la nomenclatura de los virus se utilizó las siguientes
denominaciones: vB (virus Bacteriano), Eco (E. coli), raya baja (no se
ha identicado la familia viral), primer número (número de muestreo),
segundo número (número de muestra) y tercer número (número de
fago aislado según la actividad lítica) [1].
Identificación de virus colifagos en granjas de pollos de engorde en Azuay / Astudillo-Riera y col. ________________________________
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Puricación del ADN de los colífagos aislados
Se tomaron 5 aislados, considerando aquellos fagos que presentaron
mayor actividad lítica frente a las cepas de E. coli patógenas. Para
la amplicación de cada uno de los aislados de estos colífagos se
inocularon 20 µL del fago en 200 mL de LB con E. coli TOP10F. Se dejó
incubando durante toda la noche a 37 °C en agitación a 200 rpm. Al
día siguiente se centrifugaron los 200 mL a 2.500 × G por 15 min y se
recuperaron los fagos en el sobrenadante.
Un total de 250 mL de la solución con colífagos se mezclaron con
50 mL de la solución de Polietilenglicol 6000 y NaCl 20 % / 2,5 Molar
(M) (PEG / NaCl). Se dejó reposar toda la noche a 4 °C para favorecer
la precipitación. Al siguiente día se centrifugó la suspensión de fagos
en tubos Falcon (Thermo Scientic, 339652, Thermo Scientic,
EUA) de 50 mL a 3.000 × G por 10 min a 4 °C. Luego el sedimento
resultante, se mezcló con 8 mL de la solución buffer SM (Tris HCl
5 %, NaCl 2 % y MgSO
4
0,8 %) por tubo. Se dejaron en refrigeración
por 2 horas (h). Posteriormente se añadieron 40 µL de la solución
de ARNasa (Ribonucleasa pancreática bovina), 20 miligramos por
mililitro (mg·mL
-1
) por tubo y se dejó incubar a 37 °C durante una h.
Concluida la incubación, se agregaron 2 mL de PEG/NaCl y se dejó
en refrigeración a 4 °C de 2 a 4 h. Luego se centrifugó a 2.500 × G
por 15 min. Se recogió el sobrenadante y se colocó en tubos de 20
mL con 2 mL de buffer SM los cuales se dejaron en refrigeración
una h. De cada tubo se extrajeron 3 mL y se colocaron en 2 tubos
Eppendorff de 1,5 mL. Luego se centrifugaron a 4.200 × G por 10
min. Se eliminó el sobrenadante y se agregó más solución (1,5 mL) a
los tubos de 20 mL y se volvió a centrifugar igual al procedimiento
anterior. Se eliminó el sobrenadante y se reservó el sedimento de
cada tubo centrifugado, se colocó en tubos Falcon, se agregaron 4
mL del buffer SM y se dejó a 4 °C durante toda la noche. Después se
tomaron 2 muestras de cada tubo y se colocaron en tubos Eppendorf
de 1,5 mL. A cada tubo se le agregaron 20 µL de la solución de ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 0.5 M, pH 8.0 más 5 µL de la solución
de proteinasa K (Serina proteasa inespecíca derivada del hongo
Engyodontium album, Sigma), 20 mg·mL
-1
. Se incubó en baño María
(Memmert, CE, Schutzart, Alemania) a 60 °C por 2 h. Después de
esto se colocaron 500 µL de la solución de Fenol:Cloroformo:Ácido
isoamílico (25:24:1) y se centrifugó a 14.000 × G por 10 min. Se tomaron
300 µL del sobrenadante y se colocaron en otro tubo, luego se
agregaron 480 µL de Isopropanol. Se dejó a temperatura de -20 °C
toda la noche (Congelador Indurama, Dos P, Indurama, Ecuador).
Luego de retiradas las muestras del congelador se dejaron reposar
a temperatura ambiente. A continuación, se procedió a centrifugar
las muestras a 14.000 × G por 10 min a 4 °C. se retiró con una pipeta el
Isopropanol de cada tubo. A estos tubos se les agregaron 500 µL de
solución de Etanol al 70 % (para lavado). Se centrifugó a 14.000 × G por
10 min a 4 °C. Se retiró la solución de Etanol al 70 % y se dejaron secar los
tubos con el sedimento a temperatura ambiente por 15 min. Se agregaron
40 µL de agua desionizada a cada tubo y se colocaron en baño María
(Memmert, CE, Schutzart, Alemania) por 20 min a 61 °C. A continuación,
se realizó una resuspensión en 200 µL de agua desionizada; seguido se
colocaron a baño María por 20 min a 61 °C. Por último, las muestras de
material genético total fueron almacenadas a 4 °C.
Identicación molecular de los colifagos por RFLP
Para obtener un total de 500 nanogramos (ng) de material genético
extraído de los cinco colifagos seleccionados, se realizó el cálculo
de la concentración de ADN con la utilización del espectrofotómetro
(Biotek, Epoch, BioTek, EUA) y su adaptador Take 3 (Biotek, Epoch,
BioTek, EUA), para así obtener la concentración adecuada de material
genético y resultados más homogéneos en los ensayos RFLP.
Los ADN extraidos de los colífagos fueron sometidos a las enzimas
de restricción: BamHI (Thermo Scientic, #ER0051, EUA), EcoRI
(Thermo Scientific, #ER0271, EUA), EcoRV (Thermo Scientific,
#ER0301, EUA), y Hind III (Thermo Scientic, #ER0501, EUA). Se
utilizaron entre 3 a 4 µL de ADN de fagos, a los cuales se les añadieron
aproximadamente entre 8–9 µL de agua desionizada (de acuerdo a las
cantidades de material genético presente en cada muestra) y 1,5 µL
de la enzima correspondiente. Se incubaron toda la noche a 37 °C en
estático. Las reacciones de digestión con cada una de las enzimas de
restricción se retiraron de la incubadora y se les añadieron 1,5 µL de
solución tamponada de carga para ADN 6X [Bromofenol azul 0,03 %,
xileno cianol FF 0,03 %, 60 milimolar (mM) de EDTA, pH 7.6 y glicerol
60 %], más 5 µL de Colorante SYBR Green 10.000X (Invitrogen, Ref.
S7567); esta mezcla se homogenizó en el Vortex (IKA, Lab dancer, IKA,
EUA). Luego se incubó a 37 °C por 10 min. Se realizó la preparación
del gel al 1,2 %, utilizando agarosa (Invitrogen, Cat. No. 16500-500)
y Buffer TAE 1X (Tris-acetato de 0,04 M, EDTA 1 mM y pH 8.0). Las
muestras fueron retiradas de la incubadora y se cargaron 20 µL de
cada de ellas en cada pozo del gel de agarosa, y adicionalmente se
colocaron en otro pozo, 5 µL del marcador de peso molecular [Thermo
Scientic Gene Ruler 1 kilobase (kb) Plus DNA Ladder, #SM1331, EUA].
Se corrió la cámara electroforesis horizontal (Biometra, Compactt
XS/S, Biometra, Alemania) por una h y media, con 90 de Voltios. Una
vez concluidas las corridas de cada una de las reacciones de digestión,
se realizó la documentación de la imagen con el fotodocumentador
ultravioleta (UV) (Bio Rad, Gel Doc XR+, Bio Rad, EUA) [12].
Análisis de información
Se estimaron frecuencias relativas, absolutas, se construyeron
histogramas y tablas de contingencia con el programa estadístico
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión 27.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de fagos en granjas avícolas y plantas beneciadoras
de aves
En la TABLA I se muestra los resultados de los aislamientos de
fagos obtenidos de las diferentes muestras sólidas y líquidas. Todas
las muestras resultaron indistintamente positivas en su aislamiento,
tanto muestras sólidas como líquidas. Las muestras líquidas (70 %)
y sólidas (30 %) obtenidas de granjas de aves con colibacilosis y
plantas beneciadoras de aves respectivamente, resultaron positivas
en el aislamiento de fagos colifagos. Se reporta que las fuentes
más comunes de colifagos son aguas residuales de desechos de
animales domésticos y plantas de tratamientos de aguas residuales, y
posteriormente las heces [33]. La mayor presencia de bacteriófagos
en las aguas residuales puede explicarse por el hecho de que la
abundancia de fagos en el agua dulce, su habitad principal, es 10
a 20 veces mayor que la abundancia de las células hospedadoras o
bacterias [13].
Las diluciones nales de las mezclas de fagos mostraron títulos
individuales máximos de actividad bacteriolítica que van desde 1/100
hasta 1/100.000 (TABLA I). Este resultado es relevante para determinar
el efecto de las condiciones de almacenamiento en la estabilidad de los
fagos a largo plazo. Algunos autores, analizando la pérdida de título de
FIGURA 2. Capacidad lítica individual (%) por bacteriófago frente
a 10 aislados de E. coli patógenas caracterizadas molecularmente
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bacteriófagos, mantenidos a temperatura ambiente durante 1 y 2 años,
observaron que en los fagos almacenado durante 1 año se produjo una
pérdida de 6 logaritmos (log) en el título en tanto que, no se detectaron
placas de lisis después de 2 años de almacenamiento [2, 10].
Capacidad lítica de bacteriófagos frente a cepas E. coli
Para evaluar la capacidad lítica, se desaaron los 36 aislados
de bacteriófagos contra 10 cepas de E. coli provenientes de casos
clínicos (FIG. 2), obtenidos del biobanco del laboratorio de Biología
Molecular de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
de Cuenca, Ecuador [35].
TABLA I
Colifagos provenientes de muestras líquidas y sólidas de granjas
avicolas y plantas beneciadoras de aves con actividad lítica y
diluciones optimas de su actividad bacteriolítica frente a la cepa
E. Coli Top10F´
No. Bacteriófago
Estado de
la muestra
Dilución
Positivo /
Negativo
1
vB-Eco_121 Líquido 1:100.000 Positivo
2
vB-Eco_122 Líquido 1:100.000 Positivo
3
vB-Eco_131 Líquido 1:100.000 Positivo
4
vB-Eco_132 Líquido 1:100.000 Positivo
5
vB-Eco_133 Líquido 1:100.000 Positivo
6
vB-Eco_141 Sólido 1:100.000 Positivo
7
vB-Eco_142 Sólido 1:100.000 Positivo
8
vB-Eco_161 Líquido 1:100.000 Positivo
9
vB-Eco_171 Líquido 1:10.000 Positivo
10
vB-Eco_181 Sólido 1:10.000 Positivo
11
vB-Eco_211 Líquido 1:10.000 Positivo
12
vB-Eco_241 Sólido 1:10.000 Positivo
13
vB-Eco_242 Sólido 1:10.000 Positivo
14
vB-Eco_251 Líquido 1:10.000 Positivo
15
vB-Eco_252 Líquido 1:10.000 Positivo
16
vB-Eco_261 Líquido 1:10.000 Positivo
17
vB-Eco_321 Líquido 1:10.000 Positivo
18
vB-Eco_322 Líquido 1:10.000 Positivo
19
vB-Eco_323 Líquido 1:10.000 Positivo
20
vB-Eco_324 Líquido 1:10.000 Positivo
21
vB-Eco_331 Sólido 1:10.000 Positivo
22
vB-Eco_322 Sólido 1:10.000 Positivo
23
vB-Eco_341 Sólido 1:1.000 Positivo
24
vB-Eco_411 Líquido 1:1.000 Positivo
25
vB-Eco_431 Sólido 1:1.000 Positivo
26
vB-Eco_441 Líquido 1:1.000 Positivo
27
vB-Eco_442 Líquido 1:1.000 Positivo
28
vB-Eco_451 Líquido 1:1.000 Positivo
29
vB-Eco_461 Líquido 1:1.000 Positivo
30
vB-Eco_462 Líquido 1:1.000 Positivo
31
vB-Eco_471 Líquido 1:1.000 Positivo
32
vB-Eco_472 Líquido 1:1.000 Positivo
33
vB-Eco_481 Líquido 1:1.000 Positivo
34
vB-Eco_491 Sólido 1:1.000 Positivo
35
vB-Eco_492 Sólido 1:1.000 Positivo
36
vB-Eco_410 Líquido 1:1.000 Positivo
Los fagos tuvieron diferente comportamiento; los niveles de lisis
se explican como el porcentaje de cepas que fueron afectadas por los
fagos. Se observó que el 25 % de los fagos no mostraron capacidad
lítica contra ninguna cepa de E. coli. El 75 % restante mostró distintos
niveles de lisis bajas, medias y alta. Por otra parte, los fagos que sí
presentaron capacidad lítica, mostraron diferentes niveles de acuerdo
a la observación del halo (FIG. 3). Del total de 36 aislados de colífagos
evaluados frente a 10 cepas patógenas de E. coli, 22 afectaron entre
el 10 – 50 % de las cepas bacterianas evaluadas, 5 fagos infectaron
entre el 60 y 70 % de bacterias y solo 9 fagos (25 %) no mostraron
capacidad lítica frente a las cepas patógenas de E. coli (FIG.3).
FIGURA 3. Capacidad lítica de los fagos a 10 aislados de E. coli
patógenas caracterizadas molecularmente. El nivel de lisis se
explica como el porcentaje de cepas que fueron afectadas
FIGURA 4. Porcentajes de cepas patógenas de E. coli que fueron o
no afectadas por cada fago. Las barras color rojo muestran los 5
fagos seleccionados con capacidad lítica entre 60 y 70 % frente a
las 10 cepas bacterianas molecularmente identicadas
Identificación de virus colifagos en granjas de pollos de engorde en Azuay / Astudillo-Riera y col. ________________________________
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Egas en 2016 reportó el aislamiento de un fago de aguas residuales
capaz de lisar una cepa de E. coli enteropatógena multirresistente,
aislada de casos de diarrea en niños del Ecuador; el fago tuvo un
amplio espectro de actividad lítica frente a miembros de la especie
E. coli tanto comensal como a dos patotipos diferentes, mostrando
actividad lítica alta y media sobre tres cepas diferentes [10]. Herrera
y Trujillo en 2016, obtuvieron tres fagos líticos contra cepas de E. coli
y Salmonella choleraesuis, sin embargo, no pudieron encontrar un
fago que pudiera lisar la E. coli O157:h7 [16].
En este estudio se observó que un 25 % de los bacteriófagos no
pudieron lisar a ninguna cepa de E. coli. Varios son los factores
que pudieran afectar la capacidad lítica de los fagos. Se reportan
diferencias en cuanto a la sensibilidad de los fagos al cloroformo
usado como conservador, tiempo de exposición a la UV mayores
de 40 segundos (s), tiempos de adsorción inferiores a 15 min de la
mezcla fago-bacteria. El bacteriófago es sensible a temperaturas
altas ya que a 55; 60 y 70 °C, en tan solo 5 min de exposición pueden
ser inactivados [44].
Caracterización molecular (Ensayos RFLP)
Para la caracterización molecular de los fagos se seleccionaron
los cinco con mayor capacidad lítica o sea aquellos que demostraron
una actividad bactericida entre el 60 y el 70 % frente a los aislados
de E. coli (FIG. 4). Fue posible diferenciar varios patrones de bandas
del ADN de fagos, mediante ensayos RFLP, digeridos con las cuatro
enzimas de restricción BamHI, EcoRI, EcoRV y Hind III (FIG.5).
De acuerdo a los perles observados, el fago vB-Eco_122 fue
digerido por las cuatro enzimas, el fago vB-Eco_133 solo se observa
digestión con la enzima EcoRV. Los fagos vB-Eco_211, vB-Eco_441 y
vB-Eco_442 no fueron digeridos por la enzima EcoRI pero sí por las
tres restantes. Los fagos vB-Eco_122, vB-Eco_133 y vB – Eco_211
muestran una clara diferencia entre sí, de acuerdo a la posición de
sus bandas de restricción. Sin embargo, los fagos vB – Eco_441 y
vB – Eco_442 muestran similitudes en la distribución y ubicación de
las bandas de restricción, resultado posiblemente de sus genomas
homólogos (FIG. 5).
En la TABLA II se resumen los patrones de restricción enzimática
obtenidos mediante la técnica RFLP para cada uno de los fagos
evaluados indicando patrones iguales y diferente de acuerdo a la
distribución de sus bandas.
En cuanto a la capacidad lítica de los fagos vB-Eco_441 y vB-Eco_442,
los cuales presentan patrones similares de bandas en los ensayos
RFLP, presentaron algunas diferencias. En ambos el nivel de lisis fue
el mismo sobre las mismas cepas, a excepción de la cepa 6, sobre
FIGURA 5. Gel de Electroforesis en Agarosa del Ensayo RFLP de los
fagos seleccionados. Fagos: vB-Eco_122, vB-Eco_133, vB-Eco_211,
vB-Eco_441 y vB-Eco_442. Enzimas: BamHI (1), EcoRI (2), EcoRV (3) y
Hind III (4). Marcador de peso molecular (M)
FIGURA 6. Gel de Electroforesis en Agarosa del Ensayo RFLP de los fagos
seleccionados con la enzima EcoRV como una repetición del ensayo.
Carril 1: vB-Eco_122. Carril 2: vB-Eco_133. Carril 3: vB-Eco_211. Carril 4:
vB-Eco_441. Carril 5: vB-Eco_442. Carril 6: Marcador de peso molecular
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la cual el fago vB-Eco_441 tuvo una lisis baja, a diferencia del fago
vB-Eco_442, el cual mostro una lisis nula (FIG. 6).
En un estudio realizado por Oliveira y col. aislaron fagos de aguas
residuales, logrando diferenciar genéticamente tres bacteriófagos
líticos mediante la observación de bandas discriminatorias en cada
patrón de restricción de ADN de fago según la enzima utilizada [31].
Estos autores muestran, por el contrario, que en su estudio hubo
colifagos diferentes en su estructura molecular con diferentes
actividades fagolíticas sobre las cepas de E. coli a las cuales afectaron
[31]. López y col., tras someter el ADN de fagos a ensayos de restricción
con seis enzimas, observaron que cuatro de ellas no pudieron digerir
ninguno de los ADN, únicamente dos de ellas lo hicieron. Con esto
obtuvieron cuatro fagos aislados y caracterizados genéticamente [23].
Para la caracterización de bacteriófagos especícos de biopelículas
por Bacillus cereus en supercies de acero inoxidable, en instalaciones
de procesamiento de alimentos, se utilizó con éxito la técnica RFLP;
los ADN de bacteriófagos aislados extraídos se digirieron con cinco
endonucleasas de restricción (BamHI, EcoRI, Hind III, Hin6I y TaqI);
ninguno de los ADN de fagos extraídos fue susceptible a BamHI y
HindIII, mientras que las enzimas EcoRI, Hin6I y TaqI dieron como
resultado perfiles de restricción muy similares para los fagos
seleccionados; indicando que los fagos seleccionados tenían tamaños
de genoma similares y posiblemente estaban muy relacionados [14].
En este estudio se obtuvieron cuatro aislados de fagos diferentes
molecularmente, de los cinco analizados mediante RFLP. Los
TABLA II
RESULTADOS DE ENSAYOS RFLP: COMPARACIÓN
DE PATRONES DE RESTRICCIÓN ENZIMÁTICA
N° Bacteriófago Enzima
Resultado
Igual Diferente
1 vB-Eco_122
BamHI
- 2,3,4,5
2 vB-Eco_133 - 1,3,4,5
3 vB-Eco_211 - 1,2,4,5
4 vB-Eco_441 5 1,2,3
5 vB-Eco_442 4 1,2,3
1 vB-Eco_122
EcoRI
- 2,3,4,5
2 vB-Eco_133 - 1,3,4,5
3 vB-Eco_211 - 1,2,4,5
4 vB-Eco_441 5 1,2,3
5 vB-Eco_442 4 1,2,3
1 vB-Eco_122
EcoRV
- 2,3,4,5
2 vB-Eco_133 - 1,3,4,5
3 vB-Eco_211 - 1,2,4,5
4 vB-Eco_441 5 1,2,3
5 vB-Eco_442 4 1,2,3
1 vB-Eco_122
Hind III
- 2,3,4,5
2 vB-Eco_133 - 1,3,4,5
3 vB-Eco_211 - 1,2,4,5
4 vB-Eco_441 5 1,2,3
5 vB-Eco_442 4 1,2,3
Identificación de virus colifagos en granjas de pollos de engorde en Azuay / Astudillo-Riera y col. ________________________________
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resultados uctuaron debido a que algunas enzimas no fueron capaces
de digerir a un fago, pero sí a otro, propiedad individual factible de ser
utilizada para la identicación del colifago. La resistencia especíca
a la digestión enzimática podría deberse a factores tales como la
resistencia a la restricción por parte del fago debido a la presencia
de bases hipermodicadas, como la hidroximetilcitosina (hmC) o
la hmC glicosada en el ADN viral [21]. Otros factores que podrían
estar implicados son la variación o inexistencia de la secuencia que
reconoce a la enzima. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de la
presencia de compuestos contaminantes que no fueron desechados
en la puricación de ADN, pudiendo haber interferido inactivando
determinada enzima de restricción [37].
CONCLUSIONES
○
Se conrmó la presencia de colifagos en aguas residuales de
plantas beneciadoras de aves y muestras sólidas provenientes
de galpones avícolas de granjas de pollos de engorde con
diagnóstico de Colibacilosis, en la provincia de Azuay, Ecuador.
○ Se obtuvieron cuatro aislados de bacteriófagos con diferente
capacidad lítica sobre un alto porcentaje de cepas patógenas de
E. coli, previamente identicadas molecularmente, obtenidas
de granjas de la zona con casuística de colibacilosis aviar.
○
La caracterización molecular por RFLP de los ADN de colífagos
seleccionados, mostró diferencias en el material genético
de forma eficaz y sencilla, mediante patrones de bandas
exclusivas para cada fago y con diferentes susceptibilidades
frente a las enzimas de restricción
○
La capacidad lítica de los fagos pudiera ser independiente de
su estructura molecular.
○
Estos colifagos pudieran ser utilizados para enfrentar la
colibacilosis aviar en sustitución de la terapia habitual de
antibióticos, reduciendo así el riesgo del desarrollo de la
resistencia bacteriana de las E. coli patógenas.
AGRADECIMIENTOS
La identicación molecular de E. coli patógenas y colifagos se realizó
gracias al apoyo del laboratorio de Biología Molecular de la Facultad
de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca, Ecuador.
Conictos de interés
No existen conictos de interés.
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