DOI: https://doi.org/10.52973/rcfcv-e32135
Recibido: 20/04/2022 Aceptado: 09/05/2022 Publicado: 11/06/2022
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Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32135, 1 - 6
RESUMEN
Helicobacteriosis es una enfermedad causada por Helycobacter pylori,
que se caracteriza por producir inamación de la mucosa gástrica,
provocando gastritis, úlcera péptica o incluso cáncer gástrico. Como
reservorio natural del H. pylori ha sido considerado el hombre, no
obstante, diversos estudios han conrmado la presencia de bacterias
espirales en perros y gatos. Dada la estrecha relación que existe
entre mascotas y seres humanos, algunos investigadores apuestan
a la posible transmisión zoonótica entre ellos. Para diagnosticar la
presencia de H. pylori actualmente hay pruebas de inmunoensayos
enzimáticos, no invasivos, prácticos, cómodos y de fácil aplicación.
Debido a esta particularidad se realizó la presente investigación, cuyo
objetivo fue el diagnóstico de la presencia de antígenos de H. pylori
en heces fecales de perros que asistieron a consulta Veterinaria en
la ciudad de Cuenca, Ecuador, mediante la técnica de micro ELISA.
El análisis estadístico contempló pruebas estadísticas descriptivas
y ji-cuadrado; se estudiaron algunos factores predisponentes que se
midieron en la consulta veterinaria, tales como el sexo, la edad, tipo
de alimentación, compañía de otro animal y el hábitat. Los resultados
obtenidos indican que de los 92 pacientes evaluados solo 11 (12%)
de ellos resultaron positivos a la EIA Test Kit®. Estos hallazgos
conrman que el H. pylori está ampliamente distribuido en perros.
Entre los factores predisponentes estudiados, a excepción de la
compañía entre perros y gatos, los demás factores analizados en esta
investigación no afectaron la prevalencia de la enfermedad. El sexo
aproximó diferencia al 6%, destacando que la helicobacteriosis es
más frecuente en hembras que en machos. Para concluir se conrma
la existencia de H. pylori en perros, convirtiéndole por lo tanto en un
posible ente de difusión de este germen en la población.
Palabras clave: Helicobacteriosis; inmunoensayos; infecciones
bacterianas; antígenos
ABSTRACT
Helicobacteriosis is a disease caused by Helicobacter pylori,
which is characterized by producing inammation of the gastric
mucosa, causing gastritis, peptic ulcer or even gastric cancer. As
a natural reservoir of H. pylori has been considered man, however,
several studies have conrmed the presence of spiral bacteria in
dogs and cats. Given the close relationship that exists between
pets and humans, some researchers bet on the possible zoonotic
transmission between them. To diagnose the presence of H. pylori
there are currently tests of enzymatic immunoassays, non-invasive,
practical, comfortable and easy to apply. Due to this particularity, the
present research was carried out, whose objective was the diagnosis
of the presence of H. pylori antigens in feces of dogs that attended
a Veterinary consultation in the city of Cuenca, Ecuador, using the
micro ELISA technique. The statistical analysis included descriptive
and chi-square statistical tests; some predisposing factors that were
measured in the veterinary inquiri were studied, such as sex, age,
type of feeding, company of another animal and habitat. The results
obtained indicate that of the 92 patients evaluated, only 11 (12%) of
them tested positive for the EIA Test Kit®. These ndings conrm that
H. pylori is widely distributed in dogs. Among the predisposing factors
studied, with the exception of the companionship between dogs and
cats, the other factors analyzed in this research did not affect the
prevalence of the disease. The sex approximated a difference of
6%, highlighting that helicobacteriosis is more frequent in females
than in males. To conclude, the existence of H. pylori in dogs was
conrmed, thus making it a possible entity for the dissemination of
this microorganism in the population.
Key words: Helicobacteriosis; immunoassays; bacterial infections;
antigens
Detección de Helicobacter pylori mediante la técnica micro ELISA en
muestras fecales en perros (Canis lupus familiaris)
Detection of Helicobacter pylori using the micro ELISA technique in fecal samples
in dogs (Canis lupus familiaris)
Yessenia Montaño-Gualán
1
* , Nathalie Campos-Murillo
1
y Edy Castillo-Hidalgo
1
1
Universidad Católica de Cuenca, Postgrado. Cuenca, Azuay, Ecuador.
*Correo electrónico: jessimontano-92@hotmail.com
Detección de Helicobacter pylori en caninos, mediante técnica ELISA / Montaño-Gualán y col. __________________________________________
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INTRODUCCIÓN
El Helicobacter pylori es una bacteria Gram negativa con forma de
bacilo helicoidal que habita en el epitelio gástrico de los animales y
humanos [22]. La infección por H. pylori se caracteriza por producir
inamación de la mucosa gástrica, la cual puede progresar llegando a
producir gastritis, úlcera péptica y representa un factor importante en
el desarrollo de cáncer gástrico, por lo que es considerado un agente
carcinógeno de tipo I en el humano, produciendo adenocarcinomas
o bien el linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), siendo
declarada en 1994 por la Organización Mundial de la Salud (OMS)
carcinógeno biológico denitivo” [1, 6].
Como reservorio natural del H. pylori ha sido considerado el
hombre, no obstante diversos estudios realizados a nales del siglo
XIX han determinado la presencia de bacterias espirales también
en el estómago de perros (Canis lupus familiaris) y gatos (Felis catus)
sanos y con sintomatología de enfermedades gástricas; por lo que,
la identicación de estos microorganismos en perros es relevante,
debido al rol patogénico que estas bacterias espirales desempeñan
y sus evidencias sustanciales del potencial zoonótico [23]. Estudios
revelan que el estrecho contacto de las mascotas con seres humanos
permiten manifestar una probable transmisión zoonótica al haber un
predominio bacteriano en la mucosa gástrica de los perros, dando
prioridad a estudios de las infecciones bacterianas ocasionadas por
este patógeno e importancia dentro de la Medicina [9].
En los animales, el espectro de hospedadores es amplio e incluye
distintos mamíferos como perros, felinos, hurones (Mustela putorius
furo), nutrias (Lutrinae), suinos (Sus scrofa domesticus), lobos marinos
(Otaria avescens), entre otros; además, se ha logrado amplicar el
ácido desoxirribonucleico (ADN) bacteriano a partir de materia fecal
de numerosas especies, principalmente mamíferos, pero también en
un número pequeño de aves y reptiles [26]. Esta capacidad de infectar
a un amplio número de especies es una muestra de su éxito en la
colonización de vertebrados y también de la diversidad que podría
albergar el género. Las bacterias gástricas encontradas en perros
son: H. felis, H. bizzozeroni, H. salomonis, Flexis pira rappini (H. rappini)
y H. heilmannii [4, 31]. La infección se ha detectado en cachorros de
tan solo de 2 meses (mes) y hasta perros adultos de 11 años de edad
(ADE), así como en gatos de 5 mes a 10 ADE, Helicobacter spp. se ha
sugerido como un factor etiológico de gastritis crónica [7, 10, 12].
Por lo tanto, el contacto con animales de compañía se considera
como un medio de transmisión, aunque no se ha podido asociar
en todos los casos reportados. En perros y gatos, al igual que en
el humano, la infección con estas bacterias es causa de gastritis
crónica; en cuanto a los síntomas, las personas infectadas pueden
presentar dolor epigástrico agudo o crónico, así como náuseas, acidez
estomacal, vómito, defecación irregular, dicultad para comer y
disminución del apetito [15], también ha sido reportada la coinfección
de especies animales con H. pylori en un mismo hospedador [1].
Algunos estudios indican que el H. pylori no está presente en perros,
siendo las formas más comunes de Helicobacter que se encuentran
en los perros felis y heilmannii. Otras especies encontradas en perros
son H. rappini y H. salomonis. Las bacterias habitan el revestimiento
mucoso del estómago y las cavidades glandulares. En el humano,
la infección persiste durante toda la vida, aunque se ha descrito su
eliminación natural, siendo el modo de transmisión más común de
persona a persona o por el contacto directo con la saliva, vomito e
incluso las heces fecales [24].
La prevalencia de estas bacterias espiriformes en perros uctúa
entre un 67-100%. H. bizzozeronii, seguido de H. heilmannii, H. salomonis
y H. felis en menores proporciones [2]. A pesar de esto, la especie que
más ha sido aislada en humanos asociada a infección por caninos es
H. heilmannii [4].
Estas especies encontradas en perros y gatos suelen ser de un
mayor tamaño y más espiraladas que H. pylori, por lo cual pueden
diferenciarse fácilmente al microscopio óptico, aunque no pueden
diferenciarse entre sí, por lo que actualmente, para mencionar a estas
bacterias cuando son identicadas por su morfología y no a nivel de
especie, se utiliza el término Helicobacter no H. pylori “non-H. pylori
Helicobacter”. (NHPH) [14, 15].
La ciencia asegura que los perros y gatos pueden ser colonizados por
diversas especies de Helicobacter spp., las cuales cuentan con diversas
variedades como H. felis, H. bizzozeronni, H. salomonis (cultivables)
y H. bilis en estómagos caninos, todos ureasa y catalasa positivos,
semejantes en longitud y grosor [1]. Las infecciones ocasionadas por
estos microorganismos se pueden proveer por dos o más especies
de Helicobacter, tanto en perros como en gatos siendo las más
encontradas las variedades de H. fennelliae, H. cinaedi, H. canis y H.
bilis en perros aisladas de materia fecal e intestino a diferencia de H.
canis y H. bilis que fueron aisladas del hígado [13, 14, 18].
Existen diferentes métodos para diagnosticar la infección por H.
pylori; uno es detectando anticuerpos o antígenos especícos en una
muestra de sangre del paciente o de heces. En el humano también
se utiliza la prueba del aliento con urea, en la cual el paciente bebe
urea marcada con C
14
o C
13
, produciéndose posteriormente (debido
al metabolismo de la bacteria) dióxido de carbono marcado, el cual
es detectado en la respiración. Otro método de diagnóstico es la
biopsia, al igual que el método histológico o de cultivo celular. Uno de
los métodos de detección más sensibles corresponde a la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), la cual permite también identicar
genes asociados a virulencia (CagA y VacA), genes asociados a
adhesión (BabA) y genes de resistencia a antibióticos [14, 21, 32].
En la actualidad, los métodos de diagnóstico más utilizados, al no
ser invasivos, siendo prácticos, baratos, cómodos y de fácil aplicación
son los inmunoensayos enzimáticos y la PCR, ya que son métodos
conables para diagnosticar una infección activa y conrmar un
tratamiento efectivo [27, 33].
La prueba de EIA del antígeno de H. pylori (Kit) es un inmunoensayo
enzimático de fase sólida basado en el principio de doble sándwich
para la detección semicuantitativa del antígeno de H. pylori en heces
humanas, no obstante, utilizada en perros y gatos [33]. La metodología
consiste en poner en contacto la placa del micropocillo, la cual está
recubierta con un anti-H monoclonal (anticuerpos Pylori). Tomada las
muestras de heces del paciente, se procede a extraer los antígenos
(H. pylori) con una solución de extracción y se agregan a la placa
de micropocillos recubierta de anticuerpos con los anticuerpos
conjugados enzimáticamente contra H. pylori. Si los especímenes
contienen antígenos, se unirán a los anticuerpos recubierto en la
placa de micropocillos y este conjugado formará complejos antígeno-
conjugado, en caso no presentar antígenos los complejos no se
formarán. Después de la incubación inicial, la placa de micropocillos
se lava para eliminar materiales no enlazados, se agregan sustrato
A y sustrato B y luego se incuban para producir un color azul que
indica la cantidad de antígenos presentes en los especímenes. Se
agrega una solución de ácido sulfúrico a la placa del micropocillo para
detener la reacción que produce un cambio de color a partir de azul
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a amarillo, la intensidad del color que corresponde a la cantidad de
antígenos de H. pylori presentes se mide con un lector de microplacas
(As Instruments, AMR-100, LabX Scientic, Mexico) a 450/630-700
nanomeros (nm) o 450 nm [20, 21].
Siendo esta técnica sencilla, especica y práctica, aunado a la
importancia que a salud pública se reeren las infecciones con H.
pylori, tanto para animales como las personas; se realizó la presente
investigación, donde se diagnosticó la presencia de antígenos de H.
pylori en heces fecales de perros en la ciudad de Cuenca mediante
la técnica de microElisa, contribuyendo al diagnóstico del agente
causal de la patología y el posterior control de la Helicobacteriosis.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo de estudio
El presente estudio corresponde a un análisis descriptivo transversal.
Muestras analizadas
El estudio se realizó en las parroquias el Valle sector Santa Ana
y Llacao sector Zhiquir de la ciudad de Cuenca: Ecuador, donde se
llevaron a cabo muestreos aleatorios de muestras fecales en perros
aparentemente sanos que llegaron con sus dueños a la campaña
de esterilización de la Universidad Católica de Cuenca, pero con
sintomatología de disfunciones gastrointestinales, lográndose obtener
un total 92 muestras aptas para la detección de helicobacteriosis, a
través de la técnica de micro ELISA.
Preparación de la muestra
Las muestras obtenidas fueron recolectadas en envases estériles y
transportadas a 4°C en una nevera portátil de anime hasta al laboratorio.
Para emplear la técnica planteada en la investigación se trabajó con
Inmunoensayo enzimático (EIA Test Kit®), la cual contiene una solución
de extracción, un Wash Buffer, H. pylori Antigen Conjugate , Substrate
A, Substrate B, Stop Solution.
El procedimiento fue realizado de la siguiente forma: los reactivos
fueron atemperados. El Kit contiene envases para aplicar 1 mililitro
(mL) de Extraction Solution, más una considerable cantidad de muestra
fecal (aproximadamente 1 gramo (g)), las cuales fueron centrifugadas
(Science Med, DM4012S, Cer America Lanita, Finlandia) a 410G por
un lapso de 5 minutos (min), para la toma del sobrenadante de la
centrifugación se requirió de los pocillos que vienen en el Kit y se
tomaron 5 microlitros (μL) de suero de la muestra fecal, previamente
centrifugada más 100 μL de Substrate A, se homogenizó y se resguardó
de la luz solar por un tiempo de 30 min. Al cumplirse este tiempo se
procedió a eliminar el reactivo y se lavó 3 veces con 250 μL de Wash
Buffer, sin dejar burbujas, a continuación se añadieron 100 μL de H.
pylori Antigen Conjugate, de igual manera se homogenizó y se cubrió de
la luz por un tiempo de 10 min y al culminar este tiempo se desechó el
reactivo y se agregó 50 μL de Substrate B y 50 μL de Stop Solution, se
leyó mediante el equipo de micro ELISA Reader (Rayto, RT2300, China).
Cabe recalcar que en las muestras positivas existe un viraje en el
reactivo (cambian de color el reactivo de turquesa a amarillo intenso)
como determina la norma técnica del Kit y el manual de prácticas
de laboratorio.
Análisis estadístico
Se emplearon pruebas estadísticas descriptivas de distribución de
frecuencias, además de las inferenciales ji-cuadrado, determinando
cuantos pacientes resultaron positivo o negativo en la prueba de
micro ELISA. Así mismo, se tomó en cuenta el sexo del animal, la
edad mediante la metodología de Tuemmers y col. [30] (grupo etario:
Jóvenes de 1 a 5 ADE; Adultos de 5 a 8 ADE y Viejos mayor de 8 ADE), el
tipo de alimentación (balanceado, casero o mixta), agua administrada
(potable o cruda) y compañía de otro animal (solo, o con otra especie);
todo ello se evaluó mediante el test exacto de Fisher, mediante el uso
del programa estadístico SAS versión 9.1.3 [28].
RESULTADOS Y DISCUSION
Los resultados obtenidos indican que de los 92 pacientes
evaluados, solo 11 (12%) de ellos resultaron positivos a la EIA Test
Kit®, los restantes 81 (88%) resultaron negativos (FIG 1).
Estos hallazgos positivos de las pruebas inmunológicas indican
que H. pylori está ampliamente distribuido en perros, convirtiéndole
por lo tanto en un posible ente de difusión de este germen en la
población. Elharri y col. [8] indicaron que, el H. pylori produce una
de las infecciones bacterianas más comunes entre los humanos y
a su vez se encuentra también distribuidas entre el ganado bovino
(Bos taurus) y los perros en Egipto. En ensayos experimentales con
perros gnotobióticos, se ha visto que esta bacteria fue capaz de
colonizar el estómago [17].
Asi mismo Waheeb y col. [33], compararon las técnicas de ELISA vs
PCR y encontraron la presencia de H. pylori en las heces de perros y
gatos, con una tasa de casos positivos 20,5% por ELISA y 22,7% por la
prueba de PCR. Este valor superior de +2% indica la clara sensibilidad
que posee la prueba del PCR, al necesitar para su diagnóstico, mucha
menos cantidad del microorganismo presente en la muestra.
FIGURA 1. Resultados de los caninos analizados por el EIA Test Kit
®
,
para diagnostico de Helicobacter pylori
Detección de Helicobacter pylori en caninos, mediante técnica ELISA / Montaño-Gualán y col. __________________________________________
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Por mucho tiempo se pensó que, la posibilidad de contagio
perro:hombre o la de hombre:perro, era poco probable, aunque ya
se habían conseguido H. heilmannii, H. salomonis y H. felis en pacientes
humanos, y producto de una contaminación vía indirecta [4, 18, 31].
Aunque los modos de infección no están claros, parece ser que
ese contacto estrecho entre personas y animales es un factor de
riesgo importante para que se dé la zoonosis, siendo esta posibilidad
ya señalada por Fox [11]. Al igual que los hallazgos encontrados por
Husson y col. [19], y Dore y col. [5], al conseguir anticuerpos para H.
pylori en trabajadores de mataderos en Francia y al norte de Cerdeña
que habitaban en una misma habitación, con sus perros pastores.
Araujo-Soto [1] destaca el amplio espectro de hospedadores para el
H. pylori, el cual incluye distintos mamíferos, demostrando el potencial
zoonótico de estas bacterias. Logrado amplicar ADN de la bacteria a
partir de materia fecal de numerosas especies [26]. La detección de
ADN en un amplio número de especies es una muestra de su éxito en
la colonización de vertebrados y también de la diversidad que podría
albergar el género, destacando su capacidad de infectar distintos
hospedadores y la presencia de más de una especie en un mismo
antrión.
En la TABLA I se puede apreciar el número de casos negativos
y positivos encontrados en perros, de acuerdo al posible factor
predisponente. En la misma se puede apreciar que a excepción de
la compañía entre perros y gatos, los demás factores estudiados en
esta investigación (edad, tipo de alimentación, el hábitat) no afectan la
mayor o menor tasa de contaminación con H. pylori en esta población.
El sexo acerca una diferencia estadística al 6%, indicando que la
helibacteriosis es más frecuente en hembras que en machos, también
es cierto que en este estudio se presentaron en una proporción 2:1,
entre hembras y machos.
A pesar de que la edad no resultó ser estadísticamente signicativa,
se aprecia que la mayor tasa de animales positivos se encontró en
las categorías cachorros y jóvenes, presentándose cero (0) casos en
adultos. Estos resultados coinciden con lo reportado por Gómez y col.
[13], quienes arman que no existe asociación por género en los perros,
ni correlación del grado de densidad de colonización con la edad, a
diferencia de los gatos, en los que es más frecuente esta bacteria en
animales adultos que en cachorros. Hänninen y col. [16], describieron
la transmisión de H. salomonis de una madre a sus cachorros, por lo
que se sospecha que la transmisión sería oral-oral u oral gástrico, por
el íntimo contacto que tiene la madre con sus cachorros.
El tipo de alimento consumido al igual que el agua de consumo de
los perros, son al parecer otro probable elemento a considerar en la
transmisión y contagio por H. pylori. Vesga-Perez [32] estudiaron la
detección y viabilidad de esta bacteria en aguas crudas y potables en
tres plantas de potabilización en la ciudad de Bogotá; en el mismo, se
logró demostrar la presencia de células cultivables de H. pylori en 56 de
las 310 muestras de las tres plantas de potabilización (11-24%). También
se detectó ADN de H. pylori en las 3 plantas por PCR convencional y
PCR cuantitativa (qPCR), llegándose a cuanticar H. pylori en 13 (8,4%)
muestras de agua cruda y en 20 (12,9%) de agua potable, siendo el
genotipo vacA m1/s1, el que mostró mayor frecuencia.
En los humanos, la infección con H. pylori está relacionada con el
nivel socioeconómico, condiciones higiénicas incorrectas, estrés, y
un grado elevado de una mala alimentación es adquirido por la ingesta
oral del microorganismo y transmitido principalmente dentro de las
familias en la infancia [4], y se da a través de contacto oral-oral, fecal-
oral o ambas, probablemente durante la infancia, inuyendo el bajo
nivel socioeconómico, la existencia de un familiar portador de H. pylori
y el consumo de agua no potable [3]. En perros, las malas condiciones
sanitarias y el hacinamiento parecen facilitar la propagación de la
infección, tal y como sucede en refugios, donde la prevalencia de
Helicobacter llega a ser del 100%.
En este estudio (TABLA I) se ve que los perros solos o en compañía con
otros perros, presentaron la mayor tasa de contagio; mientras que los
perros acompañados con gatos en su casa, solo presentó una prevalencia
de 5,36 vs 20-33,3%, respectivamente (P<0,03). Aparentemente, la
transmisión entre perros y entre gatos es oral-oral y fecal oral, ya que
se ha detectado ADN de Helicobacter en saliva, placa dental y heces de
perros y gatos con y sin signos gastrointestinales [25, 29].
El método por el cual se transmite esta infección sigue siendo
desconocido, pero debido a su mayor prevalencia en perros de refugio,
la transmisión oral y/o fecal se considera una posibilidad. Este supuesto
se apoya en la presencia de organismos similares a Helicobacter,
llamados GHLO (gastric Helicobacter-like organisms), en el vómito, las
heces y la saliva de los animales que han sido infectados [29].
CONCLUSIONES
Se conrma que la existencia H. pylori con un 12% de muestras
positivas, lo cual es indicativo que el microorganismo se encuentra
ampliamente distribuido en perros, convirtiéndole por lo tanto en un
posible ente de difusión de esta bacteria en la población.
De los factores estudiados solo el sexo y la posible relación mostraron
efecto, indicando que es mas frecuente en hembras y en perros que
viven solos.
TABLA I
Prevalencia de H. pylori de acuerdo al sexo, edad, tipo de
alimentación, hábitat y la compañía de otro animal
Factor
Predisponente
Categoría
Negativo
(%)
Positivo
(%)
Valor-P
Sexo
Hembras 83,6 16,4
a
0,06
*
Machos 96,8 3,2
b
Edad
Cachorros 86,8 13,2
NSJóvenes 87,8 12,2
Adultos 100,0 0
Tipo de
Alimentación
Balanceado 100,0 0
NSCasera 92,6 7,4
Mixta 85,5 14,5
Compañía
Solos 66,7 33,3
a
0,03
*
Con otros perros 80,0 20,0
a
Con perros y gatos 94,6 5,4
b
Hábitat
Dentro de casa 76,9 23,1
NS
En el patio 88,4 11,6
A la intemperie 100,0 0
*
= valor signicativo; NS= valor no signicativo; superíndices diferentes
dentro del mismo grupo de un factor, expresan diferencias estadísticas
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Se destaca así mismo, que en la actualidad se cuenta con una técnica
de micro ELISA, que a partir de muestras de heces, como método no
invasivo, permite detectar antígenos de H. pylori y se posiciona como
una prueba de diagnóstico altamente sensible y especíca, para la
detección temprana de infecciones por Helicobacter, lo que podría
ser considerado dentro de los planes de control y erradicación de H.
pylori, tanto en animales como en humanos, sobre todo en aquellos
grupos ocupacionales que por su trabajo, mantienen un contacto diario
y estrecho con animales de compañía.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores certican que no existen conictos de interés en el
presente trabajo.
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