DOI: https://doi.org/10.52973/rcfcv-e32133
Recibido: 28/04/2022 Aceptado: 11/05/2022 Publicado: 11/06/2022
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Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32133, 1 - 5
RESUMEN
El objetivo de este estudio fue determinar la presencia de parvovirus
canino en perros geriátricos que asistieron a consulta con
sintomatología gastrointestinal compatible con parvovirosis canina
en el periodo octubre a diciembre del año 2021 en una clínica veterinaria
del sur de Quito, Ecuador, mediante diagnóstico molecular (PCR), se
tomó muestras de heces del recto con un hisopo y se homogenizó (10%
p/v) en solución ARN Latter. Las heces suspendidas fueron separadas
por centrifugación y se utilizó alícuotas de 200 µL de los sobrenadantes
para extraer el ADN. Para el diseño de cebadores y sonda del GenBank
fueron recuperadas secuencias de nucleótidos de la partícula viral VP2
de algunas cepas del CPV-2, las cuales fueron alineadas mediante el uso
del software Primer 3. Los números y las cepas usadas para la alineación
fueron: CPV2: CPV-b, M38245 y CPV-Northern, M19296; CPV2a: CPV-15,
M24003 y CPV-31, M24000; CPV-2b: CPV-39, M74849 y CPV-133, M74852;
CPV-2 Glu426 mutante: 56/00, AY380577. Para la identicación de la
región objetivo del ensayo se realizó por visualización de la alineación
de la secuencia para amplicar un fragmento conservado de 93 pb
dentro de las secuencias alineadas de VP2. Se realizó PCR en tiempo
real con un sistema de detección en tiempo real y estos datos fueron
analizados con el software detector de software MXpro Real time qPCR
(versión 3.0). La mezcla de PCR de 25 µL para la reacción contiene el
mastermix Q Script, los cebadores (laboratorio VetNAAT), Eva Green
y agua libre de nucleasas hasta completar la reacción. Se detectó el
virus en el 28% de los pacientes geriátricos muestreados.
Palabras clave: Parvovirosis; geriátricos; PCR; gastroenteritis
ABSTRACT
The objective of this study was to determine the presence of
Canine Parvovirus in geriatric dogs that attended consultation with
gastrointestinal symptoms compatible with canine parvovirus in
the period from November to December 2021 in a Veterinary Clinic
in the South of Quito, Ecuador by molecular diagnosis (PCR), stool
samples were taken from the anus with a swab and homogenized
(10% w/v) in RNA Latter solution. Suspended faeces were separated
by centrifugation and 200 µL aliquots of supernatants were used to
extract DNA. For the design of primers and probes from GenBank,
VP2 nucleotide sequences were retrieved from some CPV-2 strains,
which were aligned using Primer3 software. The numbers and strains
used for the alignment were: CPV2: CPV-b, M38245 and CPV-Northern,
M19296; CPV2a: CPV-15, M24003 and CPV-31, M24000; CPV-2b:
CPV-39, M74849 and CPV-133, M74852; Mutant CPV-2 Glu426: 56/00,
AY380577. Identication of the target region of the assay was rst
performed by visual sequence alignment to amplify a conserved 93
bp fragment within the aligned VP2 sequences. Real-time PCR was
performed with a real-time detection system and these data were
analyzed with MXpro Real time qPCR software detector software
(version 3.0). The 25 µL PCR mix for the reaction contains the Q Script
master mix, the primers (VetNAAT lab), Eva green and nuclease-free
water until the reaction is complete. The virus was detected in 28%
of geriatric patients sampled.
Key words: Parvovirus; geriatrics; PCR; gastroenteritis
Diagnóstico molecular de la Parvovirosis canina en perros geriátricos
Molecular diagnosis of Canine Parvovirus in geriatric dogs
Jonathan Eduardo Muncha-Mullo
1
* y Manuel Maldonado-Cornejo
2
1
Universidad Católica de Cuenca, Posgrado. Cuenca, Azuay, Ecuador.
2
Universidad Católica de Cuenca. Cuenca, Azuay, Ecuador
*Correo electrónico: jmuncha@udlanet.ec
Parvovirosis canina en perros geriátricos, diagnóstico por PCR / Muncha-Mullo y Maldonado-Cornejo _______________________________
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INTRODUCCION
La Parvovirosis canina (CPV) es causada por el parvovirus canino tipo
2 (CPV-2), el cual es un virus que afecta a los canidos; perros salvajes
(Lycaon pictus), perros domésticos (Canis lupus familiaris), zorros
comedores de cangrejos (Cerdocyon thous), mapaches (Procyon),)
y lobos con melena (Chrysocyon brachyurus), causando cuadros de
gastroenteritis graves en animales susceptibles, que pueden ir desde
diarreas sanguinolentas hasta provocar la muerte del individuo siendo
la mortalidad entre el 20 y 40% [15].
El CPV es de tamaño pequeño, mide 20 nanomeros (nm) y pertenece
a la familia Parvoviridae, no posee envoltura lipídica, tiene cápside
de forma icosaédrica, tiene ácido desoxirribonucleico (ADN) de
cadena simple en sentido negativo [15]. La familia Parvoviridae se
encuentra dividida a su vez en dos subfamilias clasicada por su rango
y hospedador: La subfamilia Parvovirinnae afecta a los vertebrados y
la Densovirinae afecta a insectos y algunos artrópodos [15].
El CPV afecta al tracto gastroentérico invadiendo las criptas
intestinales conduciendo a un acortamiento de las vellosidades
reduciendo la capacidad de absorción y digestión causando diarreas
sanguinolentas [11].
Los parvovirus necesitan para su replicación, una célula en división
rápida nuclear, en donde forma cuerpos de inclusión intracelular [15].
Se considera que el CPV-2 surgió de una mutación de un virus con
características similares al de la panleucopenia viral felina (FPLV), el
cual logró adaptarse a los caninos; en el mercado existen vacunas
disponibles y a pesar de esto el CPV es el agente etiológico más
relevante en enfermedades virales del tracto gastroentérico, sobre todo
en cachorros. El CPV-2 es la cepa original y ha tenido varias mutaciones
lo cual ha dado inicio a la aparición de nuevas variantes [9].
En la década de los 70 surgió el primer brote de CPV, clasicado de
tipo II y desde ese momento ha sufrido varias alteraciones genéticas
(mutaciones) en su hospedador nal el perro, generándose desde
entonces nuevas cepas [15]. Más adelante, a principio de los 80, esta
cepa original sufrió una mutación genética y apareció el CPV tipo
2ª [15]. En el año 1984 apareció la variante CPV tipo IIb, esto como
consecuencia de una adaptación genética por parte del virus, la cual
ayudó a que éste pueda replicarse y propagarse de una forma más
ecaz en caninos susceptibles y establecer periodos de incubación
más cortos, entre 4 y 5 días (d) [15].
La forma de propagación del virus se dio mediante la excreción
por vía fecal, reportándose en las heces en una proporción de 10
9
partículas virales, referente a una dosis media de un cultivo tisular, la
cual se da durante el periodo agudo de la enfermedad; en esta fase,
los animales susceptibles se podrían infectar rápidamente por vía del
contacto oro-fecal o con uidos de líquidos tisulares (melena) [8].
El virus (CPV) es resistente a las condiciones ambientales, lo cual
hace que la enfermedad esté presente en las poblaciones caninas,
debido a su fácil diseminación [8] pudiéndose transmitir a partir de
los 8 a 12 d post infección, y excretándose por las heces de pacientes
infectados, los cuales a su vez se convierten en reservorios del virus [8].
Entre los factores predisponentes de la enfermedad se citan, la edad
y el estado inmunitario del perro, que determinan si el individuo se
pueda infectar y sobrevivir tras la infección [8]. Luego del periodo de
incubación, que oscila entre 4 a 7 d, los pacientes infectados presentan
cuadros repentinos de vómitos, diarreas, anorexia y ebre [8].
El CPV afecta a perros de cualquier edad presentándose en
cachorros con mayor frecuencia, en pacientes adultos que han
sido vacunados se han encontrado casos positivos, sin embargo la
enfermedad en estos pacientes no es tan agresiva y en pacientes
geriátricos inmunocomprometidos se han reportado casos con cuadros
gastroentéricos hemorrágicos [14].
Las vacunas son una herramienta indispensable en Medicina
Veterinaria que ayudan a controlar la presencia de enfermedades
infecciosas en los animales de compañía, sin embargo existen factores
que pueden interferir en una correcta inmunización como por ejemplo,
la inmunización en cachorros menores a 5 semanas (sem) de edad ya
que los anticuerpos maternales pueden interferir en la inmunización,
de aquí la importancia de cumplir con un correcto calendario de
vacunación para que la vacuna tenga un efecto adecuado y pueda
proteger de las enfermedades infecciosas a lo largo de la vida del
paciente [10].
Existen casos de animales positivos para CPV pese a tener vacunas
dentro de su calendario de salud, sin embargo no han sido colocadas
dentro del tiempo establecido, estos pacientes han logrado superar a
la enfermedad en menor tiempo y con mínimas complicaciones frente
a pacientes con presencia del virus y sin calendario de vacunación [6].
Los factores de riesgo para que un animal pueda infectarse del CPV
están relacionados a la alimentación, los animales que consumen carne
cruda, huesos y alimento casero, animales con cargas parasitarias
gastroentéricas, mal estado de salud, y la falta de un calendario de
vacunación [2].
La transmisión de CPV también se puede dar por fómites tales como:
platos, zapatos, juguetes, bebederos, jaulas, entre otros, que tuvieron
contacto con heces o vómitos de perros enfermos [16]. Tras la ingestión,
la replicación viral primaria se da en los órganos linfoides orofaríngeos,
ganglios linfáticos mesentéricos y el timo. El virus se generaliza de los
sitios primarios de la replicación por vía sanguínea hacia las células
del intestino delgado y células epiteliales de la lengua, cavidad oral
y esófago [1]. Otros órganos blanco del CPV son pulmones, hígado,
riñón, además posee cierto tropismo por las células hematopoyéticas
[1]. En cachorros se ha visto que las células del miocardio también se
ven afectadas por el virus CPV [1].
La necrosis que se produce en las células del intestino delgado,
generan un colapso de las vellosidades, generándose un colapso, de
la cual se pierde la integridad del epitelio intestinal; al perderse esta
integridad, se facilita la translocación bacteriana y la producción de
endotoxinas como consecuencia de la pérdida de la barrera epitelial
del intestino delgado, causándose así, una bacteriemia generalizada
con la lamentable muerte del paciente como consecuencia de una
falla multiorgánica [1].
Una vez que la CPV se instaura en el paciente, los signos clínicos
pueden ir desde una infección leve que pasa casi desapercibida,
hasta una infección aguda que puede ser mortal. Los principales
signos que se presentan son: la anorexia, letargia y pirexia la cual
puede progresar dentro de 1 a 2 d presentándose vómitos y diarreas
sanguinolentas, lo cual se acompaña de dolor abdominal y cuadros
de deshidratación que pueden oscilar entre 7 y 10% [12].
La CPV puede presentarse de forma cardiaca, siendo ésta otra
manera en la que ha sido reportada aunque solamente en cachorros
menores de 12 sem de edad, pudiéndose dar casos también en animales
adultos, sobrevivientes a la infección, a los cuales se le generó una
miocarditis secundaria al proceso viral, los cuales luego puedan sufrir
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fallas cardiacas sobre los 5 años de edad. La presentación cardiaca
tiene una tasa de mortalidad superior al 50%, en cachorros con
afección cardiaca por el virus presentan postración, arritmias cardiacas
evidentes en la auscultación y edemas pulmonares [12].
Un cuadro sobreagudo se ha reportado en cachorros de 4 a 12 sem
de edad, caracterizado por un aumento en la respiración, quejidos,
vómitos repentinos, llegando hasta la muerte, en solo cuestión de
minutos (min) a esta forma se le conoce como “síndrome miocárdico”
[12]. Los cachorros que logran superar este cuadro, van a presentar
más adelante, alteraciones cardiacas como: congestión cardiaca y
edema pulmonar [12]. En el cuadro subagudo se presenta diarrea leve
la cual es responsiva al tratamiento el paciente es portador sano y
tiende a no presentar episodios de hipertermia [12].
El diagnóstico clínico de la enteritis producida por parvovirus se puede
confundir como resultado de su presentación impredecible, ya que los
signos clínicos de parvovirosis pueden tener diagnósticos diferenciales
con cuadros de Salmonelosis, coronavirosis y la fase entérica del
distemper canino, entre otras enfermedades parasitarias [12]. Los
métodos que se utilizan hoy en d para la detección de CPV 2 a partir
de las heces o contenido intestinal son: la microscopia electrónica,
hemoaglutinación fecal, aislamiento viral, la aglutinación con látex,
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), inmunocromatograa y
las pruebas de ELISA [13].
Estos estudios son útiles para el diagnóstico ya que en los casos
agudos de la enfermedad, la cantidad de virus que se elimina en las
heces es considerablemente grande. Actualmente algunas pruebas
se realizan en laboratorios, pero al tener la necesidad de realizar un
diagnóstico temprano existen pruebas rápidas como es: Ensayo por
Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA), este examen se puede
realizar de forma práctica, la cual requiere de una muestra de heces
pequeña o hisopado rectal, se la realiza rápidamente y la sensibilidad
y especicidad son altas [13].
La inmunocromatografía es un método diagnóstico que consiste en
detectar antígenos de CPV y virus del distemper canino (DCV) en heces
y vómitos, dos anticuerpos monoclonales se unen especícamente a
epítopes distintos de los antígenos, posteriormente son absorbidos
en la esponja de celulosa, estos antígenos de CPV son desplazados y
se unen al complejo oro-coloide del anticuerpo de CPV el cual forma
un complejo anticuerpo antígeno [17].
Existen pruebas de diagnóstico molecular como el PCR en tiempo
real, esta técnica puede diferenciar las cepas virales al utilizar muestras
fecales frescas teniendo una sensibilidad y especicidad alta, sin
embargo su costo es elevado; las sondas genómicas MGB (Minor
Groove Binder) pueden reconocer las diferencias que existen entre
los nucleótidos de las cepas virales [7].
El diagnóstico clínico del CPV es difícil ya que la sintomatología
clínica como vómitos y diarreas es muy común en otras enfermedades
gastroentéricas, por lo cual es necesario el uso de herramientas
diagnosticas de alta sensibilidad y especicidad como el PCR en la
cual se detecta el ADN viral, siendo esta prueba un método able,
preciso y rápido para la detección del CPV, esta prueba requiere de
2 a 4 horas para la detección viral [4].
MATERIALES Y METODOS
Muestras
Para el estudio se obtuvieron 24 muestras de heces, vía rectal
de perros geriátricos (mayores a 7 años), que se presentaron en el
servicio veterinario de la clínica veterinaria del Sur de Quito durante
el periodo entre los mes de octubre a diciembre del 2021, con
sintomatología gastroentérica como diarreas y vómitos. A cada uno
de los pacientes le fue llenada la cha médica, los pacientes enfermos
presentaron signos clínicos como vómitos y ebre conjuntamente
con diarreas hemorrágicas.
Toma de la muestra
La toma de la muestra se realizó mediante el uso de un hisopo
estéril, posteriormente se colocó la muestra de heces en el buffer
ARN Latter, conteniendo el ácido ribonucleico, en un volumen de 600
microlitros (uL) en donde se conservará el material genético viral.
Luego las muestras fueron conservadas en un congelador (marca
Biobase, modelo BPR-5UV160, España) y mantenidas entre 2 y 8°C, hasta
su posterior análisis. Cada una de las muestras fue identicada con los
datos del paciente para su posterior análisis en el procesador MX3000
Multiplex Quantitative PCR (QPCR) System marca Stratagene, EUA.
Diseño experimental
El análisis estadístico se realizó mediante una estadística descriptiva
(frecuencias y porcentajes de individuos positivos y negativos),
considerando la cantidad de muestras que fueron tomadas de acuerdo
a los criterios de inclusión y exclusión que se planteó en la investigación,
en donde se tomaron para el estudio los perros geriátricos con
sintomatología gastroentérica que asistían a consulta durante los
meses de octubre a diciembre.
Extracción del ADN
Para la extracción de ADN, después de la toma de la muestra se
la colocó en solución ARN Latter, se homogenizó la muestra, se
centrifugó a alta velocidad 12.298 G y se separó las suspensiones
fecales y se usaron alícuotas de 200 µL del sobrenadante. Se utilizó
una centrifuga marca Bionote, modelo mini 10, fabricada por GYROZEN
de origen Coreana.
PCR en tiempo real
Se realizó el PCR en tiempo real mediante el uso de un sistema de
detección en tiempo real y para el análisis de los datos se utilizó el
software detector de software MXpro Real time qPCR (versión 3.0).
Para realizar la reacción, la mezcla de PCR de 25 µL contiene el
mastermix Q Script, los cebadores VetNAAT Lab, Eva Green, agua
libre de nucleasas hasta que la reacción se complete.
El protocolo que se usó en este estudio fue: a 95 ºC se activó la
Taq ADN polimerasa durante 10 min y 40 ciclos consistentes en
desnaturalización a una temperatura de 95ºC por 15 segundos (s),
se realizó la hibridación de los cebadores a una temperatura de 52ºC,
durante 30 s y extensión a temperatura de 60 ºC durante 1 min.
Parvovirosis canina en perros geriátricos, diagnóstico por PCR / Muncha-Mullo y Maldonado-Cornejo _______________________________
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RESULTADOS Y DISCUSION
En la FIG. 1 se puede observar que en este estudio se obtuvo 28%
(7/25) de positivos para CPV por PCR (Diagnóstico molecular) en el
grupo de pacientes que presentaron sintomatología gastroentérica.
importante para contraer la enfermedad, en este estudio se evidenció
que la mayor casuística de perros enfermos se dió en cachorros
menores de 6 mes de edad [2].
En un estudio realizado en Perú por Villanueva [18] se encontró
la presencia de parvovirus en pacientes de 12 a 24 mes de edad
determinando como resultado el 7%, lo cual indica que existe la
presencia de CPV en pacientes adultos, al igual que en el presente
estudio se evidenció la presencia del virus en pacientes geriátricos
y no como lo maniesta Arindaga que el PC es una enfermedad
infecciosa que se presenta solo en cachorros [3].
En un estudio realizado por Flores en Nicaragua mediante PCR
se encontró 28,9% de casos positivos a CPV (13/45) en cachorros,
el 66,7% (30/45) de los pacientes presentaron cuadros diarreicos,
el 43,3% (13/30) dió positivo para el CPV y el resto de perros que
no presentaron diarrea dieron negativo [9]. Los resultados de este
estudio se asemejan a los encontrados en la presente investigación de
acuerdo a la relación pacientes con diarrea ya que en los dos estudios
los pacientes con diarrea fueron los que dieron positivos a CPV.
CONCLUSIONES
En este estudio se comprobó la presencia de CPV en pacientes
geriátricos y que mediante la PCR, se puede diagnosticar los casos
positivos, raticando que es una excelente herramienta diagnóstica
para CPV.
Con este estudio se recomienda a los médicos veterinarios colocar
dentro de los diagnósticos diferenciales a la CPV en pacientes
geriátricos con sintomatología gastroentérica, así se puede dar un
tratamiento temprano y se puede evitar que la enfermedad se disemine,
dado que si se encontró pacientes geriátricos positivos a la enfermedad
y ocasionalmente en, la clínica diaria se pasan desapercibidos.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores certican que no existen conictos de intereses en
el presente artículo.
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De los pacientes geriátricos vacunados que se presentaron a
consulta con sintomatología gastroentérica, no se encontró ningún
caso positivo.
Del total de casos positivos, en el estatus casos por sexo, el 12%
fueron hembras y el 16% machos.
En el estudio realizado por Moncada [15] se encontró el 27% de
animales adultos con patologías gastroentéricas, lo cual se puede
asemejar con el presente estudio en donde se encontró un 28%
de perros positivos para CPV, teniendo en cuenta que en el estudio
de Moncada [15] no se realizó PCR para CPV en los pacientes con
sintomatología gastroentérica.
En la actualidad, el CPV es una de la causas principales de
gastroenteritis infecciosa en perros alrededor del mundo, teniendo
altas tasas de morbilidad y mortalidad, principalmente en cachorros
lo que diculta la tenencia y crianza de mascotas, esto implica tener
técnicas de diagnóstico de alta sensibilidad y especicidad, tanto para
instaurar un adecuado tratamiento como para evitar la diseminación
de la enfermedad, por lo cual en el estudio realizado por Cáceres [5]
utilizando PCR se logró detectar el 41,7% de cachorros infectados con
CPV mientras que, en el presente estudio se obtuvo el 28% de casos
positivos a CPV en perros geriátricos diagnosticados mediante PCR,
resultados que se asemejan a los obtenidos en el presente estudio con
la diferencia de que se encontró el 28% de casos positivos en pacientes
geriátricos con sintomatología gastroentérica.
En un estudio realizado por Azam se encontró el 14,28% de casos
positivos a CPV en cachorros con sintomatología gastroentérica,
resultados que se asemejan al presente estudio con un 28% de casos
positivos correspondientes a pacientes geriátricos [4].
En un estudio realizado por Aldaz, en donde se evaluaron los
factores de riesgo asociados a CPV ratica que la edad es un factor
FIGURA 1. Porcentaje de pacientes positivos y negativos a Parvovirosis
canina
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