DOI: https://doi.org/10.52973/rcfcv-e32103
Recibido: 15/01/2022 Aceptado: 25/02/2022 Publicado: 25/05/2022
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Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32103, 1 - 8
RESUMEN
Siendo la fasciolosis una infección parasitaria importante en rumiantes
de muchos países y dada la alta prevalencia en humanos y animales
en Cajamarca, Perú, se planteó realizar el estudio sobre el perl
de las proteínas de intestino de Fasciola hepatica con el objetivo
de conocer el número de proteínas y el rango de pH de secreción/
excreción de intestino del parásito que expresa mediante el método de
electroforesis 2D-bidimensional. Las muestras adultas de F. hepatica
se recolectaron de hígados de bovinos en el Camal Municipal de
Cajamarca. Fueron trasladadas al laboratorio de Biotecnología en
Sanidad Animal de la Estación Experimental Agraria Baños del Inca,
INIA – Cajamarca, para su procesamiento. La corrida electroforética
permitió separar 82 proteínas con diferentes pesos moleculares,
enfocadas en distintos puntos isoeléctricos en un rango de pH de
6,0 a 9,4. Se concluye que mediante el análisis del gel 2D de proteínas
de intestino de F. hepatica, se conocieron 84 spots de proteínas
con distintos pesos moleculares, enfocadas en distintos puntos
isoeléctricos en un rango de 6,0 a 9,4.
Palabras clave: Bovinos; fasciolosis; electroforesis 2D; parásitos
ABSTRACT
Being fasciolosis an important parasitic infection in ruminants in many
Countries and given the high prevalence in humans and animals in
Cajamarca, Peru. It was proposed to carry out the study on the prole
of the intestinal proteins of Fasciola hepatica with the objective
of knowing the number of proteins and the pH range of secretion/
excretion of the intestine of the parasite that it expresses by means
of the 2D-bidimensional electrophoresis method. Adult samples
of F. hepatica were collected from bovine livers in the Cajamarca
Municipal Slaughterhouse. They were transferred to the Animal Health
Biotechnology Laboratory of the Baños del Inca Agrarian Experimental
Station, INIA – Cajamarca, for processing. The electrophoretic run
allowed to separate 82 proteins with different molecular weights,
focused at different isoelectric points in a pH range of 6.0 – 9.4. It is
concluded that by analyzing the 2D gel of F. hepatica gut proteins,
84 protein spots with different molecular weights were identied,
focused on different isoelectric points in a range of 6.0 – 9.4.
Key words: Bovine; fasciolosis; 2D electrophoresis; parasites
Perl electroforético 2D de las proteínas del intestino de Fasciola hepatica
2D electrophoretic prole of Fasciola hepatica intestine proteins
Marco Cabrera-González
1
* , Diana Marlo-Javier
1
, Carlos Quilcate-Pairazamán
2
, Héctor V. Vásquez
2
y Medali Cueva-Rodríguez
1
1
Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Dirección de Desarrollo Tecnológico Agrario, Estación Experimental Baños del Inca. Baños del Inca, Cajamarca, Perú.
2
Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA), Dirección de Desarrollo Tecnológico Agrario. La Molina, Lima, Perú.
*Correo electrónico: mcabrera9@gmail.com
Perl electroforético de las proteínas del intestino de Fasciola hepatica / Cabrera y col. _______________________________________________
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INTRODUCCIÓN
La fasciolosis [1], causada por el tremátodo Fasciola hepatica, es
una enfermedad parasitaria zoonótica [28], se encuentra distribuida a
nivel mundial, según su cuadro clínico puede clasicarse en dos fases:
aguda y crónica [2]. El sitio de predilección de F. hepatica madura
son los conductos biliares en el hígado, las fasciolas adultas arrojan
huevos al tracto gastrointestinal que son liberados posteriormente
al medio ambiente en las heces. Los huevos eclosionan en el medio
ambiente y se convierten en miracidios, proceso que se da en una
temperatura de 10°C como mínima y de 22 a 26°C óptima [24, 26]. Una
vez desarrollados, los miracidios penetran en un caracol hospedador
de moluscos de la familia Lymnaeidae, cuya especie en particular varía
según la ubicación geográca actúa como el principal hospedador
intermediario en Europa [41].
Por lo que los estadios adultos ubicados en los conductos biliares
de mamíferos herbívoros requieren caracoles Lymnaea como
hospedadores intermedios para su transmisión [36]. El desarrollo de la
F. hepatica depende evidentemente de las características ambientales
[21], la fasciolosis ocasiona disminución en la producción de carne,
leche y la fertilidad, pero adicionalmente las infecciones bacterianas
secundarias debido a la inmunosupresión durante las infecciones
porF. hepaticacontribuyen a las pérdidas económicas [29, 31], el
parásito está localizado en los conductos biliares y vesícula biliar de los
animales, lo cual produce hepatitis traumática grave durante la etapa
migratoria y biliar teniendo como resultado el camino a la pérdida del
funcionamiento hepático [35], ocasiona daño alparénquima hepáticoy
alos conductos biliares, lo que puede conducir a brosis hepática[25].
El cuerpo del parásito adulto es oval y aplastado, en la cara ventral
destacan dos ventosas: una ventosa anterior (llamada también oral,
porque suele rodear a la boca) y otra ventral (llamada también acetábulo).
Las dimensiones de los adultos son muy variables según la especie:
los más pequeños no miden más de 30 micrómetros (µm), en tanto que
los más grandes pueden superar los 3 centímetros (cm) de longitud.
Presentan coloración pálida, blanquecina, y si muestran algún color vivo
se debe a los productos ingeridos que se aprecian por transparencia. En
los trematodos digenéticos adultos y sexualmente maduros se distinguen
varios tipos morfológicos, basados principalmente, en el número y
disposición de las ventosas. El cuerpo está relleno de parénquima,
que rodea a los órganos y el líquido corporal que circula entre sus
células constituye el medio de transporte de diversas sustancias. El
tubo digestivo es incompleto, pues, salvo alguna excepción, carecen
de ano, y los desechos son regurgitados. La boca se abre en la porción
anterior del cuerpo rodeada por la ventosa oral y se comunica con una
faringe musculosa, a la que sigue un esófago que se bifurca en dos ciegos
intestinales, a menudo ramicados como se apreacia en la FIG.1 [30].
El Triclabendazol (TCBZ) es el medicamento de elección para el
control de fasciolosis y los informes de F. hepaticaresistente a este
medicamento, de una amplia gama de regiones geográcas son muy
preocupantes [6]. En varios países se han informado de cepas de
ganado resistentes a los medicamentos y, lo que es más preocupante,
ha surgido en América del Sur la resistencia a los medicamentos en
casos humanos, causando enfermedades hepáticas y pulmonares
en millones de personas y ganado bovino (Bos taurus) [5, 7, 34],
considerándose un problema importante de seguridad alimentaria
y salud pública [36, 43], las fuentes de infección en humanos se
dan por ingesta de alimentos y agua, considerando que las plantas
silvestres de agua dulce como los berros (Nasturtium ocinale) son
la fuente principal, que han infectado a 17 millones de personas [27] .
Al no existir una vacuna en la actualidad para prevenir la fasciolosis,
el tratamiento depende exclusivamente del TCBZ y el uso excesivo e
inadecuado ha llevado a una resistencia generalizada, comprometiendo
el control futuro del medicamento, [31]. Por ello, el parásito ha adquirido
la capacidad de modular la respuesta inmune del hospedador en su
propio benecio mediante la liberación de productos excretores-
secretores [E/S]. En consecuencia, los productos E/S se han
considerado como una fuente potencial de inmunomoduladores /
bioterapéuticos para una serie de enfermedades inamatorias en
humanos como diabetes, esclerosis múltiple, asma, lesión pulmonar
aguda, ofreciendo una oportunidad para el desarrollo de nuevas
terapias para este tipo de enfermedades [39].
La fasciolosis es de gran importancia económica en todo el mundo
considerada como una amenaza a nivel global para la salud pública,
el bienestar animal, productividad agrícola y la seguridad alimentaria
[42], causando enormes pérdidas económicas en la agricultura [4,
10]. Según su cuadro clínico, puede clasicarse en dos fases: aguda y
crónica, actualmente el diagnóstico se realiza durante la fase crónica,
sin embargo, la detección temprana permitiría brindar un tratamiento
ecaz y oportuno [33].
Dentro del hospedador se ha demostrado que, para prolongar su
supervivencia, la F. hepatica inuye en las respuestas inamatorias
del hospedador [19]. Otros estudios demuestran el efecto del parásito
sobre la respuesta inmunitaria global de los hospedadores infectados,
la cual se modula hacia un estado de tipo 2 no proliferativo después
de un desafío natural, lo cual tiene implicaciones al momento de la
administración de los programas de vacunación y de la susceptibilidad
del hospedador a los patógenos co-infectantes [2]. Formas juveniles
de F. hepatica secretan proteasas como las catepsinas [12, 40], las
cuales permiten penetrar la pared intestinal, salir a la cavidad peritoneal
y trasladarse al hígado, en donde penetran y migran a través del
parénquima hepático dejando huellas en forma de túneles bróticos
hasta alcanzar una ubicación permanente en los conductos biliares.
Por otro lado, se ha reportado que, las proteínas biológicas, como
la Catepsina L, la glutatión s-transferasas, entre otras, participan
en la migración y el establecimiento de F. hepatica, son expresadas
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y secretadas por estos parásitos. Además, se menciona que los
productos E/Sson proteínas clave en la comprensión de la interacción
hospedador-parásito e inmunoterapia [32].
Así, debido a su ubicación en la interfaz hospedador/parásito, la
caracterización de las secreciones del parásito es importante para
desentrañar las interacciones moleculares que rigen las relaciones
entre los parásitos helmintos y sus hospedadores [3]. Por otro lado,
Hanna y col. [20] reportan en su investigación sobre inmunolocalización
e inmunodetección de los antígenos E/S de Fasciola gigantica
provenientes del ciego intestinal, glándulas vitales, gónadas y
tegumento parasitario. Con lo cual se generó el perl e identicación
de polipéptidos inmunogénicos; utilizando la técnica de Western
bloting, la cual es unatécnicade laboratorio utilizado para detectar
una proteína especíca en una muestra de sangre o tejido. El método
implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de
la muestra, la cual es una prueba que tiene especicidad y predicción
positiva de 100% y negativa de 95,71%, respectivamente, encontrando
12 polipéptidos con capacidad inmunogénica [15].
Otros estudios, realizados por Jefferies y col. [23] mediante análisis
proteómico de productos E/S de formas adultas de F. hepatica,
utilizando la técnica de electroforesis en gel bidimensional 2-D, reportó
hasta 60 proteínas prominentes de las cuales fueron identicadas 29
proteínas. Así también, Robinson y col. [38] manifestaron que, el análisis
proteómico de proteínas secretadas por formas larvales y adultas de F.
hepatica mostró que estas proteasas están reguladas en su desarrollo
y se correlacionan con el paso del parásito a través de los tejidos del
hospedador y sus encuentros con diferentes macromoléculas del
mismo hospedador, siendo las proteasas como FhCL3 y Catepsina B,
las que permiten la activación de larvas y la penetración de la pared
intestinal, mientras que FhCL1, FhCL2, y FhCL5 son necesarias para la
penetración del hígado y la alimentación de tejidos y sangre. Además
de las proteasas, los parásitos secretan una serie de moléculas
antioxidantes que son regulados de acuerdo a su migración a través
de los tejidos del hospedador.
Numerosos protocolos de laboratorio son utilizados para
identicar proteínas, siendo la técnica electroforesis 2D, importante
para la separación de proteínas por su peso molecular (PM) y carga
eléctrica [14], siendo la técnica muy utilizada en la determinación
de la composición proteica de muestras biológicas, además de ser
utilizada desde hace algunos años para determinar la presencia del
lipopolisacárido (LPS). Es una técnica que demostró ser altamente
sensible; es más sencilla que las de resonancia magnética nuclear
(RMN) y cromatografía gaseosa acoplada a masas, no requiere de
complejos equipamientos y por lo general en los laboratorios de control
de proceso de vacunas se cuenta con el equipamiento y los reactivos
necesarios para su utilización [9].
Por ello, dicha técnica se ha empleado para comparar los productos
de E/S de formas adultas de F. hepatica [3]. De esa manera, muchos
autores han evidenciado que los productos de S/E muestran un
conjunto de proteínas. Dentro de éstos, están los trabajos de Khan y col.
[19], quienes determinaron que, en productos solubles de F. gigantica
y Gigantocotyle explanatum en búfalo (Bubalus bubalis) de agua en la
India, el número máximo de bandas observadas en la electroforesis
correspondían a proteínas entre 10 – 160 kilodaltons (kDa) con puntos
isoeléctricos (pI) entre 7,0 – 9,0 seguidos por un intervalo de pI de
5,0 – 7,0; 9,0 – 10,0 y 3,0 – 5,0, esto se observó en ambos parásitos.
Por otro lado, Becerro y col. [3] realizaron un trabajo en muestras
de suero de ovino (Ovis orientalis aries) de 4 a 12 semanas (sem) post
infección con F. hepática, el cual utilizaron mediante electroforesis 2D
para la separación de proteínas, observando pI entre 5,0 y 9,8 y con
un PM comprendido entre 10 y 170 kDa; observándose 12 bandas con
pI menor a 5; además la tinción con nitrato de plata reveló un total de
448 bandas de productos de E/S. En otra investigación se realizó el
análisis de proteínas de tegumento mediante electroforesis 2D de
formas adultas de F. hepatica encontrando 14 bandas en la fracción
citosólica con la mayoría de ellos entre un rango de pH de 4,7 a 5,9
seguido del rango de 7,0 a 10,0 [26].
Asimismo, en otro estudio se realizó la identicación de mapa de
proteínas en productos de E/S y somático en F. hepatica y F. gigantica
provenientes de hígados infectados de ovejas, encontrándose 40
y 19 bandas en F. hepatica. Además, 28 y 12 bandas proteicas en F.
gigantica, respectivamente, [37]. La presente investigación tuvo
como objetivo conocer el número de proteínas y el rango de pH de
E/S de intestino del parásito que expresa mediante el método de
electroforesis 2D-bidimensional [23].
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento y cultivo de parásitos
Se recolectaron 220 fasciolas adultas de un total de 20 hígados
infectados de ganado bovino provenientes del centro de benecio local
[Camal Municipal Cajamarca, Cajamarca, Perú]; se inspeccionaron los
hígados de los bovinos para localizar las fasciolas adultas con la ayuda
de guantes estériles y pinzas metálicas de acero inoxidable, todo el
proceso se realizó con asepsia. Las formas adultas de F. hepatica
fueron colocadas y trasladadas en dos recipientes de vidrio cerrados
y rotulados, que contenían 50 mililitros (mL) de suero siológico al
0,9% y fueron mantenidas en un termo [Cooler 32 L/Wenco/Perú]
a 37°C, hasta su llegada al laboratorio de Biotecnología en Sanidad
Animal de la Estación Experimental Agraria Baños del Inca – INIA, en
el laboratorio se lavaron 3 veces en 100 mL de tampón fosfato salino
(PBS) 1X (pH 7,2) y se cultivaron en medio RPMI 1640 modicado [SAFC
Biociences con 2,05 miniMolar (mM) L-Glutamina, 25 mM Hepes]
suplementado con 10 microlitros (μL) de penicilina-estreptomicina
durante 16 horas (h) a 37°C y 5% de dióxido de carbono (CO
2
), hasta que
las formas adultas eliminaron todo su contenido intestinal [23]. Una
vez que los parásitos fueron cultivados y eliminaron sus productos
de E/S, se colocaron en la incubadora de dióxido de carbono (CO
2
)
[Memmert/ICO-50/Schwabach/ Alemania].
Obtención de intestino de Fasciola hepatica
Los parásitos fueron colocados en placas Petri estériles y con la
ayuda de un estereomicroscopio (NIKON, SMZ645, NIKON, Francia)
y un bisturí (Printer, Profesional, KEHR SURGICAL PRIVATE LIMITED,
Alemania) se diseccionaron los intestinos y fueron colocados en
micro tubos de 1500 microlitros (μL) conteniendo 100 μL de PBS
1X [pH 7,2] siendo almacenados en congelación a –20°C (Samsung,
RT35K5930S8/PE, Samsung, México), hasta su uso.
Fragmentación y homogenización de intestino de F. hepatica
Los 20 intestinos se introdujeron en un tubo ependorff de 1500µL,
luego se colocaron en nitrógeno líquido a -195°C durante 20 segundos
(seg) por 3 veces, los intestinos fueron fragmentados y homogenizados
completamente con la ayuda de un mortero hasta adquirir una
consistencia pastosa, las cuales fueron colocadas en un micro tubo
estéril de 1500 µL y fueron almacenados en congelación a –20°C
(Samsung, RT35K5930S8/PE, Samsung, México) hasta su uso.
Perl electroforético de las proteínas del intestino de Fasciola hepatica / Cabrera y col. _______________________________________________
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Extracción y cuanticación de proteína de intestino de F. hepatica
La extracción de proteína de intestino de F. hepatica se realizó
utilizando el kit comercial BugBuster
®
[Protein Extraction Reagent],
según indicaciones del fabricante, se utilizó 300 µL de reactivo
BugBuster
®
para 500 mL de muestra homogenizada de intestino en
PBS 1X. [pH 7,2] y se centrifugó a 16.000 xG. durante 20 minutos (min)
a 4ºC en centrífuga (Centrifuge 5430/5430R, Eppendorf, Alemania).
La concentración de proteínas fue determinada con el método de
la espectrofotometría, utilizando un espectrofotómetro (PCR MAX,
Lambda, Beacon Road – Stone, Reino Unido), según instrucciones
del fabricante se evaluó la absorbancia de la solución de extracción
de proteína a 595 nanomeros (nm).
Electroforesis
Se realizó electroforesis en 2D utilizando la cámara de rehidratación
[IPG Box™, GE Healtheare, Darmstadt, Alemania], se sellaron los
carriles con 3 mL de aceite mineral DryStrip Cover Fluid [Bio-Rad] y
se incubó 12 horas (h) a temperatura ambiente.
Se hizo rehidratación de tiras Immobiline DryStrip, las cuales se
utilizan para obtener un programa general de las proteínas de E/S
de F. hepatica [3] con pH de 3,0-10,0 No Lineal (NL), 7 centímetros
(cm) [7 x 3 x 0,5 milímetros (mm)] [Bio-Rad] en la cual se homogenizó
20µL de proteína suspendida de intestino en 1,25 mL de gradiente de
pH inmovilizado (IPG) con pH 3,0-10,0 NL [Bio-Rad], se colocó en el
carril con el gel de la tira hacia abajo para que hiciera contacto con
la solución resuspendida en la cámara de rehidratación.
Primera dimensión (Isoelectroenfoque – IEF)
La tira immobiline DryStrip rehidratada en la primera dimensión
[Isoelectroenfoque – IEF] se colocó en el equipo de Isoelectroenfoque
PROTEAM IEF CELL® (Bio-Rad), la técnica de IEF se estandarizó con un
coeciente de variación entre 0,24 a 0,89 [23], en dirección del polo
positivo al negativo, se selló la tira con 2 mL de aceite mineral y se
programó el tiempo y voltajes de corrida paso 1: 300 voltios (V) x 1 min
30 seg; paso 2: gradiente, 1000 V x 30 seg; paso 3: gradiente, 5000 V x
1 min 30 seg; paso 4: 5000 V x 30 seg; luego de transcurrido el tiempo
programado se retiró la tira y se equilibró para la segunda dimensión
en solución de buffer de equilibrio SDS (Tris-Hcl 75 mM, pH 8,8; Urea
6M; Glicerol 29,3% peso/volumen (P/V); SDS 2%, Bromo fenol blue a
0,002 P/V); posteriormente la tira se rehidrató en 50 miligramos (mg)
de DL-Ditiotreitol (DTT) y 125 mg de Iodoacetamina [36].
Segunda dimensión (SDS-PAGE)
Se realizó una electroforesis SDS-PAGE, para lo cual se preparó
un gel concentrador de acrilamida:bis-acrilamida al 5% y un gel de
resolución de acrilamida:bis-acrilamida al 15%; se colocó la tira en
el gel concentrador en sentido horizontal del cátodo (-) al ánodo (+)
y se aplicó una corriente de 5 miliamperios (mA), por 30 min para el
gel de concentración y 25 mA por 1,30 h para el gel de resolución,
hasta que el frente de corrida haya llegado a la parte inferior [22].
Para la coloración de las proteínas se usó 100 mL de solución
de colorante (250 mg de Coomassie brilliant blue G-250, 60 mL de
metanol, 7,5 mL de ácido acético, se agitó uniformemente en el agitador
magnético (PCE, PCE-MSR 150, Chile) evitando la formación de burbujas,
se incubó [Memmert / ICO50 / Schwabach / Alemania] el gel durante
45 min a 55°C, posteriormente se agitó y se realizó enjuague con
agua destilada por 30 min a temperatura ambiente hasta observar
las proteínas separadas por su pI y PM, las bandas de proteína fueron
analizados por el programa Gel Analyzer 2010, analiza imágenes de
gel de cualquier fuente, detección automática de carriles y bandas,
permite medir y automatizar los procesos de medida en distintos tipos
de geles, y así calcular su peso molecular [18].
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el programa
GraphPad Prism 8.1.2 [17] Free-Trial, Prism tiene un formato especíco
para los análisis que desea ejecutar, incluido el análisis de datos
cuantitativos y categóricos. Esto facilita la introducción correcta
de datos, la elección de análisis adecuados y la creación de grácos
sorprendentes [17], para PM y pI se realizó mediante prueba ANOVA,
para ver si las muestras eran paramétricas se usó la prueba Kruskal-
Wallis y las diferencias entre spots se usó la prueba “t de Student”.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El parásito F. hepatica representa un riesgo evidente para la
producción pecuaria y afecta a los seres humanos a nivel mundial;
su condición de enfermedad emergente, sumada a su prevalencia en
Latinoamérica, muestra un panorama que sugiere poner la mirada
y todos los esfuerzos necesarios en la búsqueda de alternativas de
manejo y control de este parásito [34]. La F. hepatica secreta Catepsina
L que facilita la penetración del parásito a través de los tejidos
delhospedador, participan en funciones como la alimentación y la
evasión inmunológica y experimenta cambios en su migración a través
del hospedador denitivo [13]. Las catepsinas están presentes en el
comportamiento antigénico de los productos de E/S de F. hepatica.
Se estima que la regurgitación regular del contenido intestinal del
parásito inyecta moléculas en el torrente sanguíneo donde pueden
ejercer una actividad inmunosupresora en el sistema inmunitario del
hospedador [29]. Los productos de E/S producidos por F. hepatica
son clave en la comprensión de la interacción hospedador-parásito,
éstos productos ofrecen objetivos para la inmunoterapia [28]. Del
mismo modo, otras moléculas se secretan desde el intestino, poros
excretores y tegumento de supercie del parásito hacia la bilis, para
ejercer actividad inmunosupresora y pueden llegar al exterior a través
del intestino del hospedador [13].
Las proteínas de E/S de F. hepatica interactúan entre el hospedador
y el parásito, siendo necesarias para la infección, virulencia y
supervivencia del parásito [11]. Estos productos de S/E contienen
micromoléculas, nutritivas enzimas, proteínas, metabolitos nales
los que se consideran como un cóctel de productos de E/S [8]. En
otra investigación se identicó un perl de antígenos de intestino
del parásito dando lugar a la síntesis principalmente de la cisteína
proteasas del parásito mediante vía clásica de retículo endoplásmico
/ aparato de Golgi mediante electroforesis 2D [38], con la nalidad
de obtener una visión global de todas las proteínas presentes [3, 24,
29,37]. En la investigación se presenta la electroforesis en primera
dimensión. Los pesos moleculares de las bandas fueron entre 12; 15;
17; 20; 27; 37 y 48 kDa (FIG. 2).
Con este contexto, las proteínas procedentes de muestras de
intestino de formas adultas de F. hepatica se separaron a través de
una tira de IPG de pH 3,0-10,0 mediante Isoelectroenfoque (IEF) y
posteriormente mediante electroforesis SDS-PAGE al 15%. El número
de bandas de proteínas encontradas fueron 82 bandas (FIG. 3).
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En la TABLA I se muestran el PM y pI de las proteínas del intestino
de F. hepatica, separadas en electroforesis 2D con un pH de 6,0, 7,2,
7,4, 8,0; 8,4; 9,0 y 9,4.
Asimismo, se encontró diferencia signicativa en relación al PM
en kDa y el pH de 8,4 (P<0,05) con respecto a los demás péptidos
encontrados en el intestino de F. hepatica cómo se puede apreciar
en la FIG. 4.
Estudios realizados por Issaq y col. [24] evidencian la importancia
de los avances realizados en 2D-PAGE bidimensional durante los
últimos 25 años que lo han convertido en una herramienta fundamental
en la investigación. En otra investigación realizada en ovinos (Ovis
orientalis aries) por inmunoproteómica 2D también guarda similitud
a lo encontrado habiéndose revelado 410 bandas polipéptidas
de productos de E/S de F. hepatica distribuidos entre 5 – 9,8 pI
comprendidos entre 10-170 kDa, observándose 12 bandas menor a
5 pI. [3]. Asimismo Rasaouli y col. [37] maniestan, en productos
de E/S y extractos somáticos de F. hepatica y F. gigantica mediante
electroforesis bidimensional se encontró que, al análisis cuantitativo
se mostraron 28 y 40 bandas de proteína para productos de E/S de F.
gigantica y F. hepatica, respectivamente. Para el extracto somático se
TABLA I
Carril 3 Carril 4 Carril 5 Carril 6 Carril 7 Carril 8
N° de
spot
PM
N° de
spot
PM
N° de
spot
PM
N° de
spot
PM
N° de
spot
PM
N° de
spot
PM
N° de
spot
PM
6 1 27 7,2 1 28 7,4 1 28 8,0 1 150 8,4 1 120 9 1 220 9,4 1 18
6 2 13 7,2 2 27 7,4 2 27 8,0 2 90 8,4 2 85 9 2 53 9,4 2 14
6 3 11 7,2 3 26 7,4 3 26 8,0 3 73 8,4 3 75 9 3 45 9,4 3 12
6 4 10 7,2 4 23 7,4 4 15 8,0 4 55 8,4 4 73 9 4 27 9,4 4 7
6 5 9 7,2 5 20 7,4 5 18 8,0 5 50 8,4 5 48 9 5 16
6 6 8 7,2 6 19 7,4 6 17 8,0 6 30 8,4 6 44 9 6 8
6 7 7 7,2 7 18 7,4 7 16 8,0 7 28 8,4 7 37 9 7 7
6 8 5 7,2 8 14 7,4 8 14 8,0 8 26 8,4 8 35
6 9 3 7,2 9 15 7,4 9 12 8,0 9 20 8,4 9 27
7,2 10 14 7,4 10 11 8,0 10 16 8,4 10 17
7,2 11 12 7,4 11 8 8,0 11 14 8,4 11 16
7,2 12 11 7,4 12 7 8,0 12 11 8,4 12 14
7,2 13 9 7,4 13 5 8,0 13 8 8,4 13 11
7,2 14 8 7,4 14 3 8,0 14 7 8,4 14 10
7,2 15 7 8,0 15 4 8,4 15 7
7,2 16 5 8,0 16 3 8,4 16 3
7,2 17 3
7,2 18 2
pH: Potencial de hidrógeno, PM: Peso molecular
de Fasciola hepatica*
________________________________________________________________________Revista Cientica, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32103, 1 - 14
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reconocieron 12 y 19 bandas de proteína para F. gigantica y F. hepatica,
respectivamente, con polipéptidos con un intervalo de 68 a 186 a kDa y
con pI de 4,6 a 9,39, resultados que guardan también cierta coherencia
con el presente trabajo. Otros resultados obtenidos por Gourbal y col.
[16] mediante electroforesis 2D detectaron resultados similares, donde
se pudo identicar entre 29 a 60 bandas del producto de E/S de F.
hepatica mediante electroforesis 2-D, incluidas proteasas Catepsina
L, proteína antioxidante especíca de tiol, superóxido dismutasa
(SOD), tiorredoxina peroxidasa (TPx), glutatión S-transferasa (GST),
proteína de unión a ácidos grasos (FABP) , actina, enzima glucolítica
enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; enzimas que pueden
desempeñar un papel en la migración, desintoxicación, escape del
sistema inmunológico y supervivencia de la F. hepatica en el cuerpo
del hospedador.
CONCLUSIONES
En la presente investigación se concluye que mediante el análisis
del gel 2D de proteínas de intestino de F. hepatica, se encontraron
82 spots de proteínas con distintos pesos moleculares, enfocadas
en diferentes pI en un rango de 6,0 a 9,4.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no existe conflicto de intereses con la
publicación de esta investigación.
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