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Detección y cuanticación de residuos de tetraciclina en queso por HPLC / Merchán, N. y col.
DESARROLLO DE UN MÉTODO DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
DE RESIDUOS DE TETRACICLINA EN QUESOS POR CROMATOGRAFÍA
LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)
DEVELOPMENT OF A METHOD FOR DETECTION AND QUANTIFICATION OF TETRACYCLINE
RESIDUES IN CHEESE BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
Nuri Andrea Merchán-Castellanos
1
, Astrid Maribel Aguilera-Becerra
1*
y Wilfred Edilberto Manrique
1
D o c e n t e s U n i v e r s i d a d d e B o y a c á - Tu n j a . C o l o m b i a * Autor de correspondencia
Teléfono +57 – 3017590233. Dirección electrónica: amaguilera@uniboyaca.edu.co
RESUMEN
El objetivo del estudio fue desarrollar una metodología de
alta precisión que permitiera detectar y cuanticar residuos
de tetraciclina en quesos aplicando la técnica analítica de
cromatografía liquida de alta eciencia (HPLC). Como resultado
se generó un método mediante el cual se detectaron residuos
de tetraciclina en matrices biológicas complejas como el queso.
Se establecieron condiciones de temperatura (30 °C), longitud
de onda (265 nanómetros (nm)), volumen (20 microlitros (µL))
y ujo de inyección (1 mililitro (mL)/minutos(min)), así como
la fase móvil utilizada con metanol: acetonitrilo: ácido oxálico
(74:13:13% volumen/volumen (v/v)) para la corrida en el equipo
HPLC. Se obtuvieron curvas de calibración con coeciente
de determinación (R2) próximos a 1, con concentraciones
de soluciones estándar de 2,0 partes por millón (ppm), 1,5
ppm, 1,0 ppm, 0,8 ppm, 0,6 ppm, 05 ppm, para tetraciclina. El
método presentó límites de cuanticación para tetraciclina de
0,1 miligramos/Litro (mg/L) y límite de detección de 0,2 mg/L,
valores que se encuentran por debajo de los límites máximos
permisibles por la norma colombiana para leches. Por otra
parte, se establecieron condiciones para realizar el proceso de
extracción de los residuos de antibióticos en matrices biológicas
complejas, como buer, tiempo y temperatura de centrifugación,
tipo de cartucho para puricación y reactivo de recuperación
entre otras. Se concluye que el porcentaje de recuperación fue
adecuado y se evidencia que el método permite la detección de
los residuos de antibióticos a partir de muestras biológicas.
Palabras clave: C r o m a t o g r a f í a l í q u i d a d e a l t a p r e c i s i ó n ( H P L C ) ;
queso; tetraciclina; antibacterianos
ABSTRACT
The aim of this study was to develop a high-precision methodology
that would allow the detection and quantication of tetracycline
residues in cheeses using the Liquid Chromatography High
Eciency (HPLC) analytical technique. As a result, a method
was generated in which tetracycline residues were detected
in complex biological matrices such as cheese. Conditions of
temperature (30 ° C), wave length (265 nanometres (nm)),
volume (20 microlitres (µL) and injection ow (1 millilitres mL /
minutes (min)) were established, as well as the mobile phase
used with methanol: acetonitrile: oxalic acid (74 : 13: 13%
volume/ volume (v/v)) for the assay on the HPLC machine.
Calibration curves with coecient of determination (R2) close to
1 were obtained, with concentrations of standard solutions of 2.0
parts per million (ppm), 1.5 ppm, 1.0 ppm, 0.8 ppm, 0.6 ppm,
0.5 ppm, for tetracycline. The method presented quantication
limits for tetracycline of 0.1 milligrams/Litter (mg/L) and detection
limit of 0.02 mg/L, values that are below the maximum limits
allowed by the Colombian standard for milk. On the other hand,
conditions were established to carry out the extraction process
of the antibiotic residues in complex biological matrices, such as
buer, centrifugation time and temperature, type of cartridge for
purication and recovery reagent, among others. It is concluded
that the recovery percentage was adequate, and it is evident
that the method allows the detection of antibiotic residues from
biological samples.
Key words: C r o m a t o g r a p h y h i g h p r e s s u r e l i q u i d ( H P L C ) ; c h e e s e ;
tetracycline; anti-bacterial agents
Recibido: 15/04/2020 Aceptado: 06/09/2020
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Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXX, N° 4, 180 - 185, 2020
INTRODUCCIÓN
El queso es un producto lácteo de gran importancia en la
nutrición humana [24]. Se estima que hay más de 2.000 variedades
de queso, entre madurados, semi-madurados y frescos [21, 22].
El queso es obtenido del proceso de coagulación enzimática de
la leche de vaca (Bos taurus) cruda entera o descremada [19].
Las tetraciclinas presentan una estructura común de
octahidronaftaceno, formado por cuatro anillos condensados, y
por su amplio espectro antimicrobiano [2], y de gran uso en las
prácticas ganaderas para la prevención y control de múltiples
enfermedades infecciosas; no obstante, las tetraciclinas, al
igual que cualquier medicamento administrado a los animales
son llevados por el torrente sanguíneo y sus residuos pueden
encontrarse en la leche, en cantidades que dependen de la dosis
y el intervalo entre la de administración y el ordeño del producto
que irá para el consumo humano [1].
Uno de los principales residuos de antibióticos en alimentos
son los del grupo de las tetraciclinas [26], dado su amplio uso
para el tratamiento de enfermedades en el ganado bovino,
especialmente contra la mastitis [8]. Si bien, la concentración de
antibióticos en la leche destinada al consumo humano es baja,
el consumo continuo de estas sustancias puede llegar a producir
reacciones alérgicas, así como generar cepas de bacterias
resistentes. [9].
La Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Federal Drug
Administration (FDA) han establecido normas para la ingesta
diaria admisible y los niveles máximos de residuos de antibióticos
en los alimentos, con el n de evitar los efectos nocivos de los
residuos de medicamentos en la leche y sus derivados. En el
caso de Colombia, se ha establecido 100 nanogramos(ng)/
gramos(g) como límite máximo para la tetraciclina [15]. El
objetivo del presente estudio fue desarrollar una metodología
de alta precisión que permitiera detectar y cuanticar residuos
de tetraciclina en quesos aplicando la técnica analítica de
cromatografía liquida de alta eciencia (HPLC).
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos y equipos
Los patrones y reactivos empleados fueron grado
analítico: metanol, acetonitrilo, etanol, ácido oxálico anhidro
(Merck), disodium dihidrogenofosfato (NaH
2
PO
4
), ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) y ácido cítrico monohidratado
(Sigma-Aldrich). La solución de buer McIlvaine-Na
2
EDTA para
la extracción del antibiótico en muestras de queso fue preparada
disolviendo 1,29 gramos (g) de ácido cítrico monohidratado,
2,76 g de Na
2
HPO4 y 0,37 g de Na
2
EDTA en 100 mililitros (mL)
en agua destilada, con pH ajustado a 4,0 ± 0,05 con 0,1M HCl
o 0,1M NaOH. Esta solución fue preparada semanalmente y
almacenada en refrigeración (Refrigerador No Frost Marca
Electrolux DW42X 2 Puertas 386 L Colombia). Las soluciones
estándar de tetraciclina 99% de pureza (Sigma-Aldrich) fueron
diluidas en agua milli-q para obtener concentraciones de 0,5;0,6;
0,8; 1,0; 1,5 y 2,0 miligramos (mg)/litros(L), se protegieron de
la luz y se mantuvieron en refrigeración hasta por una semana
(sem).
Para la preparación de las muestras se empleó la centrifuga
Sorvall Primo R, balanza analítica Adventure Ohaus ± 0.0001 g,
ltros de jeringa Whatman (Merck), Cartucho Oasis HLB polymeric
sorbent (3 mL 200 mg) (Waters, Milford, EUA. En la determinación
del antibiótico de tetraciclina (TC) se utilizó un equipo de HPLC
Perkin Elmer series 200 de bomba binaria e inyector automático
Coreano. La separación fue realizada utilizando una Columna
Phenomenex Luna 5 micras (µ) C18 (150 x 4,6 milímetros (mm)).
Para evidenciar la presencia del analito se utilizó un detector
de rayos ultravioleta(UV), marca Beacon Pet, modelo 2002,
fabricante Ramdal - Alemania. La fase móvil fue preparada con
metanol, acetonitrilo y ácido oxálico 50 milimolar(mM) en una
proporción de 74:13:13 volumen(v/v), ltrada y desgasicada. La
temperatura de la columna fue de 30 °C con un ujo de inyección
de 1,0 mililitros (mL)/minutos(min).
Preparación de la muestra
Aproximadamente 5 ± 0,001 g de matriz de queso fueron
homogeneizadas con 20 mL de solución de extracción buer
McIlvaine-Na
2
EDTA pH 4.0 y forticadas con 2,0 mg/mL de
solución patrón de tetraciclina. La mezcla se agitó en un
mezclador vórtex marca Fisherbrand™ ZX3 por 10 min y se llevó
a centrifugación por 10 min a 53,936.575 G por minuto (min) a
4 °C. El sobrenadante se transrió a un tubo nuevo y al precipitado
se le adicionó 20 mL buer McIlvaine-Na
2
EDTA. La mezcla fue
centrifugada en una centrifuga marca centric MF48R, modelo
2017 de Eslovenia, bajo las mismas condiciones anteriores y los
sobrenadantes fueron recolectados. A los 30 mL del sobrenadante
se adicionó una solución de ácido tricloroacético al 24% en un
volumen (v) igual al 10% del volumen (v) total recolectado, la
mezcla fue agitada por 1 min y mantenida a -4 °C por 15 min,
luego del cual la mezcla fue ltrada en papel Whatman con 125
mm de poro [24].
La puricación y concentración del analito fue realizada a
través de extracción en fase sólida (SPE), empleando la columna
Oasis HLB (3 mL, 200 mg). Una vez acondicionada la columna
con 3 mL de metanol (velocidad de ujo 3 mL min) y 1 mL de agua
desionizada, se pasaron 5 mL de la muestra preparada a un ujo
de 5 mL/min. Posteriormente, la columna fue lavada con 3 mL
de solución de metanol en agua desionizada al 5% y la elución
del analito se llevó a cabo con 5 mL de metanol grado HPLC con
una velocidad de ujo de 4 mL/ min [1]. Las muestras obtenidas
fueron secadas con nitrógeno gaseoso y reconstituidas con 2
mL de fase móvil. Finalmente, las muestras fueron ltradas con
membranas de celulosa de 0,22 micrómetros (µm) de poro y
dispuestas en viales para cromatografía.
Parámetros analíticos
Los límites de detección y de cuanticación se calcularon
mediante las siguientes fórmulas: Límite de detección = (Ybl +
3 Sbl/b) * (1/número de datos); Límite de cuanticación = (Ybl
+ 3 Sbl/b) * (1/número de datos), donde Ybl: Estimado de la
respuesta del blanco, Sbl: Desviación estándar del blanco, b:
Pendiente de la curva de calibración
Linealidad
1.- Se siguieron los lineamientos establecidos por la guía ICH
182
Detección y cuanticación de residuos de tetraciclina en queso por HPLC / Merchán, N. y col.
Q2(R1). Se prepararon seis soluciones estándar de tetraciclina
con concentraciones de 0,5; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5 y 2,0 mg/L. En
total se emplearon seis réplicas para cada concentración. A
los resultados experimentales se le aplicaron las pruebas de
análisis de varianza (ANOVA) y de t de Student para determinar
la linealidad, con un nivel de conanza del 95%, dichos datos
fueron analizados en el programa SPSS versión 23.0 [12].
Precisión: repetibilidad
La repetibilidad se evaluó a partir del coeciente de variación
del factor de respuesta (ICH, 2005). Se realizaron doce réplicas
en días diferentes para los límites superior e inferior (0,5; 1,0; 2,0
mg/L.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ante el amplio uso de las tetraciclinas como agentes
terapéuticos en el área veterinaria se han desarrollado diversos
métodos cromatográcos aplicados a matrices biológicas como
peces [2], carne [22], leche [4,25], miel [27], huevos [10]; sin
embargo, pocos reportes puntualizan detección de antibióticos
en matrices de queso [5, 18].
Para la optimización del presente método se tuvo en cuenta
la selección y concentración de los solventes, la determinación
de la longitud de onda y demás condiciones de la corrida. En
este contexto, los reportes indican que las tetraciclinas dos
longitudes de ondas de máxima absorción (275 y 350 nm) en
detector ultravioleta [28]; sin embargo, para este estudio fueron
ensayadas longitudes de onda de 360 y 265 nm, que si bien
ambas presentaron una respuesta alta, se observaron menos
compuestos interferentes a 265 nm en los cromatogramas, de allí
que esta longitud de onda fuera seleccionada para la detección
óptima del analito.
En la FIG. 1 se identica la señal correspondiente y el tiempo
de retención con respecto al estándar de tetraciclina que fue de
5,25 min.
FIGURA 1. CROMATOGRAMA DE TETRACICLINA A
265 nm. (a) Solución patrón de tetraciclina a una concentración
de 2,0 mg/mL. (b) Muestra de queso forticada con 2,0 mg/mLde
tetraciclina
En cuanto a los solventes, Stolker y Brinkman [ 23 ] escriben
que debido a la presencia de dos grupos cetona en la posición
1 y 11, las tetraciclinas pueden quelarse fácilmente con iones
metálicos, inclusive puede interactuar con grupos silanol durante
la separación por cromatografía líquida y ser adsorbidos en la
columna de fase reversa, pudiendo generar tailing [22]. En otro
estudio, para evitar la formación de quelatos y su absorción en
la columna de fase reversa se ensayó con el ácido oxálico [17].
Además del ácido oxálico, otros solventes como acetonitrilo y
metanol fueron evaluados en diferentes volúmenes (v), siendo
metanol, acetonitrilo y ácido oxálico 50mM (74:13:13 v/v), la
combinación óptima de la fase móvil, debido a que se presentó
la mejor resolución, obteniendo cromatogramas con un tiempo
de ejecución de 5,25 min. El empleo de estos tres solventes para
la detección de tetraciclinas ha sido reportado: la separación
de ocho tetraciclinas con un sistema de solventes de metanol-
acetonitrilo-0,5 M ácido oxálico (pH 2,0) (1: 1: 4) [18].
Para la preparación de la muestra se tomaron como referencia
varios protocolos de extracción en leche [6,11,20] y en queso
[5], los cuales tiene en común las etapas de precipitación de
proteínas con ácido tricloroacético, extracción líquida con buer
Mcllvaine en combinación con EDTA o diclorometano, seguida
por una extracción de fase sólida. Estos pasos fueron aplicados
a la metodología del presente estudio, considerando al buer
Mcllvaine sin combinación con otros compuestos como único
solvente de extracción, debido a que ha sido ampliamente
reportado como un solvente eciente en la extracción de
tetraciclinas en una diversidad de matrices biológicas [7].
Los procesos de puricación reportados en la literatura reeren
que el uso de extracción de fase sólida antes de la cromatografía
puede ser ventajoso para disminuir los efectos de supresión iónica
[9]. Para este propósito, fueron evaluados los cartuchos Oasis-
HLB, debido a su alta selectividad, por ser esté un copolímero
hidrofílico-lipofílico de N-vinilpirrolidona y divinil-bencenos, en
donde N-vinilpirrolidona (hidrofílica) aumenta la humectabilidad
del polímero en agua y divinilbenceno (lipofílico) proporciona
la retención de fase inversa necesaria para retener los analitos
[22]. El empleo de esta columna ha sido reportada por diferentes
autores [3, 14] y es recomendado para la extracción y limpieza de
productos farmacéuticos de limpieza y cuidado personal [13, 16].
Linealidad
La curva de calibración obtenida en la cuanticación de la
molécula de referencia comprendió valores entre 0,5 y 2,0
mg/L, obteniéndose un coeciente de correlación de 0,99 (FIG.
2); valor que permitió conrmar una buena linealidad entre
la concentración del analito y el área de señal de respuesta,
existiendo una respuesta a cada cambio de concentración.
183
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXX, N° 4, 180 - 185, 2020
FIGURA 2. CURVA DE CALIBRACIÓN DE
TETRACICLINA (POR TRIPLICADO) EN 50 mM DE ÁCIDO
OXÁLICO
El porcentaje de recuperación obtenido (promedio) fue de 162
± 4,7%. El tiempo de retención observado para la detección de
tetraciclina en muestras de queso forticada fue de 5,25 min
(FIG. 2).
La prueba ANOVA mostró una diferencia signicativa del área
bajo la curva por cada valor de concentración de tetraciclina
(TABLA I). Los resultados demostraron la sensibilidad del método.
No se encontraron diferencias signicativas entre las réplicas de
cada concentración.
La prueba t de Student, con un nivel de conanza del 95% y
n-2 grados de libertad indica que hay una relación directamente
proporcional entre la concentración de tetraciclina y la respuesta
instrumental, para el rango establecido de 0,5-2,0 mg/L, y
teniendo en cuenta el límite de detección (TABLA II). Se inere
que los errores sistemáticos no afectan la linealidad del método.
TA BL A I I
RESULTADOS OBTENIDOS PARA LINEALIDAD SEGÚN LA
PRUEBA T DE STUDENT (NIVEL DE CONFIANZA DEL 95%)
Coeciente de correlación
Hipótesis Ho: no hay correlación
H1: hay correlación
Conanza 0,95
Resultados tr
exp
=119
tr
exp
=2,08
Criterio de decisión Rechazar Ho
Límites de detección y cuanticación
El límite de cuanticación calculado fue de 0,1 mg/L y el límite de
detección fue de 0,02 mg/L (TABLA III).
TA B L A I I I
LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
PARA LA DETECCIÓN DE TETRACICLINAS EN MUESTRAS
DE QUESO
Y
bl
S
bl
M Factor
Límite de
cuanticación
1291,6 793,98 53017 10 0,1 mg/L
Límite de
detección
1291,6 793.98 53017 3 0,02 mg/L
Y
bl
: estimado del límite de detección del blanco, S
bl:
desviación
del estándar blanco
Precisión: repetibilidad
En la TABLA IV se presentan los resultados obtenidos teniendo
en cuenta el factor de respuesta, tomando los límites superior e
inferior, y en el punto medio del rango. El método presenta una
buena precisión a nivel de la repetibilidad, considerando que el
coeciente de variación de todos los puntos es inferior al 3%.
TA BL A I I
RESULTADOS OBTENIDOS PARA LINEALIDAD SEGÚN LA
PRUEBA T DE STUDENT (NIVEL DE CONFIANZA DEL 95%)
Coeciente de correlación
Hipótesis Ho: no hay correlación
H1: hay correlación
Conanza 0,95
Resultados tr
exp
=119
tr
exp
=2,08
Criterio de decisión Rechazar Ho
Límites de detección y cuanticación
El límite de cuanticación calculado fue de 0,1 mg/L y el límite de
detección fue de 0,02 mg/L (TABLA III).
TA B L A I I I
LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
PARA LA DETECCIÓN DE TETRACICLINAS EN MUESTRAS
DE QUESO
Y
bl
S
bl
M Factor
Límite de
cuanticación
1291,6 793,98 53017 10 0,1 mg/L
Límite de
detección
1291,6 793.98 53017 3 0,02 mg/L
Y
bl
: estimado del límite de detección del blanco, S
bl:
desviación
del estándar blanco
Precisión: repetibilidad
En la TABLA IV se presentan los resultados obtenidos teniendo
en cuenta el factor de respuesta, tomando los límites superior e
inferior, y en el punto medio del rango. El método presenta una
buena precisión a nivel de la repetibilidad, considerando que el
coeciente de variación de todos los puntos es inferior al 3%.
TA B L A I
RESULTADOS DEL ANÁLISIS DE VARIANZA PARA LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE TETRACICLINA (P<0,05)
Grados de libertad Suma de cuadrados
Promedio de los
cuadrados medios
F Valor crítico de F
Regresión 1 7752589002 7752589002 2197,92475 1,2383E-06
Residuos 4 14108925,3 3527231,32
Total 5 7766697927
184
Detección y cuanticación de residuos de tetraciclina en queso por HPLC / Merchán, N. y col.
TA B L A I V
FACTORES DE RESPUESTA OBTENIDOS EN EL ENSAYO
DE REPETIBILIDAD
Límite
superior
Punto medio Límite inferior
Área 1 130,125,25 467,67,52 28, 288,05
Área 2 129,252,36 46,325,25 28, 279,28
Área 3 129,620,195 48,224,24 28,
797,1
Área 4 132,676,21 44,113,86 29, 157,44
Área 5 133,552,25 46,184,20 29, 162,32
Área 6 134,137,54 44,386,74 27, 811,38
Área 7 127,460,58 46,112,49 27, 442,19
Promedio 130,974,912 46,016,331 28, 419,68
DE 2,497,13 1, 405,17 658,38
CV 1,9 3,1 2,3
DE: desviación estándar; CV: Coeciente de variación
Exactitud
En la TABLA V se muestran los resultados obtenidos en la
recuperación de la tetraciclina en el proceso de extracción y
cuanticación. Los resultados indican valores más altos a los
esperados y superiores al 90%.
TA BL A V
PORCENTAJE DE RECUPERACION OBTENIDO
EN EL ENSAYO DE EXCTITUD
Concentración
adicionada
Concentración
medida
Recuperación
(%)
2.0 ± 0,1 3.2 ± 0,1 37 ± 4,7
CONCLUSIONES
Se establecieron las condiciones de corrida en el equipo HPLC
para obtener señales de residuos de tetraciclina a partir de
muestras de queso, así como algunas condiciones para realizar
el proceso de extracción de los residuos de antibióticos en
matrices biológicas complejas, como buer, tiempo y temperatura
de centrifugación, tipo de cartucho para puricación y reactivo de
recuperación.
Los porcentajes de recuperación fueron adecuados, lo
que indica la eciencia del método para detectar residuos de
antibióticos.
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