RESUMEN
La conservación de espermatozoides de epidídimo es una técnica ampliamente usada en animales de alto valor genético, así como en animales silvestres muertos inesperadamente. Uno de los inconvenientes que influyen en la motilidad y integridad de membranas (plasmática y acrosomal) así como en la capacidad de fertilización de los espermatozoides epididimarios recuperados es la temperatura de almacenamiento post mortem de los epidídimos. El objetivo de esta investigación fue determinar la calidad espermática pre congelación y post descongelación de espermatozoides epididimarios de toros (Bos taurus) de la Amazonía ecuatoriana recuperados de testículos almacenados 5 o 20°C por un corto tiempo. Para este propósito se obtuvieron diez pares de testículos recogidos de un matadero. Los testículos izquierdos y derechos de cada animal fueron almacenados a 5oC (T-5) y 20oC (T-20), respectivamente durante 6 horas (h). La recuperación espermática fue realizada por flujo retrógrado de la cola del epidídimo y el líquido obtenido fue procesado con diluyente AndroMed® a una concentración de 200 x 106 espermatozoides/ mililitros mL y cargado en pajuelas de 0,25 mL. Las pajuelas de ambos grupos, T-5 (n = 30) y T-20 (n = 30), fueron congelados en vapores de nitrógeno líquido y descongeladas a 37°C durante 60 segundos (seg). El efecto de la temperatura de almacenamiento de epidídimos post mortem fueron evaluados por un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Los resultados obtenidos mostraron que en el análisis pre congelación, los porcentaje de motilidad (MIP, evaluada por microscopía óptica), vitalidad espermática (V, integridad de la membrana plasmática evaluada por la tinción de eosina / nigrosina) y anormalidades morfológicas totales (AT) de los espermatozoides del grupo T-5 no mostraron diferencias significativas (P > 0,05) con respecto al grupo T-20. En el análisis post descongelación, asimismo los parámetros de motilidad (analizados por un sistema CASA. SpermVision®, Minitube, Alemania) así como las AT, no evidenciaron diferencias significativas (P>0,05) entre los grupos T-5 y T-20. El porcentaje de V post descongelación fue superior (P<0,05) con el grupo T-5 en comparación con el grupo T-20 (63,0 ± 2,6% y 52,9 ± 3,0%, respectivamente). No obstante, en la evaluación de la funcionalidad de la membrana plasmática mediante prueba hipoosmótica (HOST) mostró mayores porcentajes (P<0,05) con el grupo T-20 en comparación con el grupo T-5 (40,4 ± 3,26% y 31,3 ± 1,99%). En conclusión, los resultados sugieren que, a pesar de las controversias encontradas en la integridad y funcionalidad de la membrana plasmática luego de la descongelación, los epidídimos de toros sacrificados en condiciones ambientales de la Amazonía ecuatoriana pueden ser almacenados a 5 o 20ºC durante un corto período de tiempo y obtener una motilidad e integridad morfológica post descongelación similar. Se recomienda realizar estudios adicionales para evaluar la capacidad de fertilización de éstos espermatozoides mediante la Inseminación Artificial (IA) bajo condiciones de campo.
Palabras clave: Espermatozoides; epidídimo; congelación; sistemas CASA
ABSTRACT
Epididymis sperm conservation is a technique widely used in animals of high genetic value as well as in wild animals dead unexpectedly. One factor that most influence in motility and sperm membrane integrity (plasma and acrosomal) as well as the fertilizing ability of epididymal spermatozoa recovered is post-mortem temperature storage of epididymis. The objective of this study was determinate sperm quality pre-freezing and post-thawed of bull epididymal sperm (Bos taurus) from the Ecuadorian Amazon recovered from testicles stored to 5 or 20ºC for short-time. For this propose, ten pairs of testicles were collected from slaughterhouse. Left and right testicles of each bull were storage at 5ºC (T-5 group) or 20ºC (T-20 group), respectively during 6 hours (h). Sperm recovery was performed by retrograde flow of the epididymis tail and the liquid obtained was diluted in AndroMed® extender at concentration of 200 x 106 spermatozoa/ mililiters mL and packed in 0.25 mL straws. Both straws T-5 (n = 30) and T-20 (n = 30) groups were frozen in vapors of nitrogen liquid and thawed at 37ºC for 60 seconds (sec). The effect of storage temperature of epididymis post-mortem were assessment by ANOVA-one way. The results showed that in pre-freezing analysis, the percentage of motility (analyzed by optical microscopy), sperm vitality (V, plasma membrane integrity analyzed by eosin- nigrosine stain) and total morphological abnormalities (TA) of spermatozoa of T-5 group did no showed significant differences (P>0.05) compared with T-20 group. In post-thawed analysis, likewise the motilities variables (assessed by CASA system, SpermVision®, Minitube, Germany) as well as TA did no showed significant differences (P>0.05) between T-5 and T-20 groups. Sperm vitality (V) in samples thawed was higher (P<0.05) with T-5 group than T-20 group (63.0 ± 2.6% y 52.9 ± 3.0%, respectively). However, in plasma membrane functionality analysis assessed by hypoosmotic test (HOST) showed higher values (P<0.05) with T-20 group than T-5 group (40.4 ± 3.26% y 31.3 ± 1.99%). In conclusion, the results suggest that, despite the controversies found in the integrity and functionality plasma membrane post-thawed, the epididymis from Bull slaughtered under environment conditions of Ecuadorian Amazon may be storage at 5 or 20ºC during short-term. Additional studies should be made to evaluate the fertilizing ability of these epididymal sperm after artificial insemination (AI) under filed conditions.
Key words: Sperm; epididymis; thawing; CASA system
INTRODUCCIÓN
La criopreservación de semen es una importante biotecnología reproductiva que busca promover la conservación espermática de los machos por tiempo indeterminado [34]. Posibilita el uso de semen preservado en amplios programas de mejora genética mediante la inseminación artificial (IA) programada [37]. Además representa una ventaja económica para el productor reduciendo costos de transporte, manejo y alimentación de reproductores [7].
Las pérdidas inesperadas de animales de alto valor genético, así como la dificultad para obtener muestras de semen de especies silvestres condujeron al desarrollo de metodologías que permitieran recuperar y criopreservar el material genético de estos animales [8, 38, 39]. Tal es el caso de la obtención post mortem de espermatozoides de la cola del epidídimo de estos animales como una opción viable para preservar su germoplasma para un futuro [14, 40]. El uso de espermatozoides del epidídimo congelados/ descongelados han sido usados en biotecnologías de reproducción asistida como la IA y la fecundación in vitro (FIV) con resultados satisfactorios en bovinos (Bos taurus) [28] y equinos (Equus ferus caballus) [40], entre otros.
La cola del epidídimo en los mamíferos es responsable del almacenamiento de espermatozoides viables hasta el momento de la eyaculación y proporciona un medio favorable para la preservación de su capacidad de fertilización durante varias semanas [21]. Sin embargo, después de la muerte del animal, los gametos no tienen una degeneración rápida, y las condiciones, tales como el tiempo y la temperatura a la que el epidídimo está expuesto, influyen directamente en la supervivencia de los espermatozoides [22].
El tiempo y condiciones óptimas para la recuperación espermática post mortem sería inmediatamente después de su muerte del animal; sin embargo, esto generalmente no siempre es posible. Los países tropicales presentan diferentes microclimas, por lo cual la recolección y la conservación apropiada de los espermatozoides del epidídimo inmediatamente de su muerte resulta difícil debido a las temperaturas ambientales muy variables (en Ecuador varían desde trópico bajo con 30°C a las alturas de la cordillera de los Andes con más de 2.500 metros sobre el nivel del mar m.s.n.m con 5°C), y a la falta de recursos humanos y/o equipos para su procesamiento [28].
Diversos estudios han demostrado que cuando se mantienen los epidídimos en frío (0 a 5°C) inmediatamente después de la muerte, la viabilidad de espermatozoides se mantiene durante largo período de tiempo en ciervos (Cervus elaphus) [12, 25], verracos (Sus scrofa domesticus) [15, 23], ratones (Mus musculus) [24], toros (Bos taurus) [29] y en caballos (Equus ferus caballus) [40]. Sin embargo, se ha demostrado que los espermatozoides viables del epidídimo se pueden recuperar de los ciervos muertos mantenidos a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C), hasta 24 horas (h) después de la muerte [17]. Además, la supervivencia y motilidad post descongelación de espermatozoides epididimarios de animales silvestres como la Cabra Montés Ibérica (Capra pyrenaica) en temporada de caza, ha sido deseable cuando los testículos han sido almacenados a temperatura ambiente hasta por 8 h, no obstante, si incrementa el tiempo de almacenamiento (por ejemplo hasta 72 h) la temperatura ideal es a 5ºC [13, 32]. Existe información limitada sobre el estado vital o de sobrevivencia funcional de epidídimos que conserven espermatozoides viables cuando los epidídimos son conservados a 20°C, lo cual podría ser una situación común cuando el deceso del animal se produce en regiones con estas temperaturas de forma permanente [18]. En consecuencia, se plantea la hipótesis de que el almacenamiento de epidídimos a una temperatura de 20ºC, equivalente a la temperatura tropical amazónica Ecuatoriana, (superior a las temperaturas de almacenamiento reportadas) mantiene las características espermáticas para lograr una congelación exitosa como lo hace una temperatura de almacenamiento a 5ºC. En efecto, el objetivo de esta investigación que fue evaluar la calidad de espermatozoides congelados/ descongelados obtenidos de la cola de epidídimos que fueron recuperados post mortem a partir de toros de matadero, y almacenados a 5 o 20°C.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección y almacenamientos de epidídimos
La recolección de los testículos de los toros se hizo en el matadero del cantón Santiago de Méndez [latitud: -2,71667; longitud: -78,3167; 650 metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.)], de la Provincia de Morona Santiago, en la Amazonia ecuatoriana. La recuperación de espermatozoides, procesamiento y evaluación de calidad espermática pre congelación y post descongelación se realizó en el laboratorio de Biotecnología de Reproducción de la granja Irquis de la Universidad de Cuenca (2.700 msnm).
Diez toros Bos taurus criados en la Amazonía ecuatoriana fueron seleccionados al azar en el matadero antes del desposte. Los criterios de selección previo al sacrificio de los animales incluyeron a toros sexualmente maduros, entre 2 y 4 años de edad, con un peso promedio de 400 kilos (kg) y una condición corporal entre 3 y 3,5 según la escala descrita por Edmonson y col. [11].
Después del sacrificio, los testículos fueron extirpados del cuerpo del toro con la túnica vaginal e inmediatamente colocados en bolsas plásticas estériles (Ziploc) con solución Ringer Lactato. Los testículos izquierdos fueron almacenados a 5ºC (T-5) y los testículos derechos a 20ºC (T-20). Las bolsas fueron selladas herméticamente y almacenadas en cajas de poliestireno para su traslado al laboratorio en la ciudad de Cuenca durante un periodo de 6 h para los análisis subsiguientes.
Recuperación, procesamiento y congelación de espermatozoides
En el laboratorio, los testículos fueron secados y removidos su tejido adyacente del epidídimo bajo condiciones de asepsia con un equipo básico de cirugía. Se ubicó la cola del epidídimo, se insertó un catéter intravenoso No. 20 y se inyectó 1 mililitro (mL) de solución madre (diluyente AndroMed® al 20%) a 37oC y por flujo retrógrado se aspiró el contenido (líquido espeso y de color blanco cremoso), según la metodología descrita por Martínez-Pastor y col. [27]. La muestra fue depositada en una caja de petri estéril a 37oC sobre una platina térmica (Minitube®, Tiefenbach, Alemania). Inmediatamente fue evaluada la concentración espermática mediante un Fotómetro SDM 1 (12300/0102, Minitube®, Tiefenbach, Alemania). El líquido espermático recuperado fue evaluado inicialmente previo a su procesamiento. Las muestras con una motilidad espermática ≥ 50%, una viabilidad ≥ 75% y anormalidades morfológicas < 20% fueron incluidas en este experimento. Las muestras fueron diluidos con AndroMed® y ajustadas a una concentración de 200 x 106 espermatozoides/ mL (concentración final 50 x 106 espermatozoides/ pajuela de 0,25 mL). Las pajuelas fueron selladas con alcohol polivinílico a 23oC (temperatura ambiente) para luego descenderla hasta 5°C en un período de 1 h. Una vez alcanzada esta temperatura, se equilibró por 2 h en una nevera (Haceb®, 320L, México) a la misma temperatura.
Las pajuelas fueron congeladas mediante vapores de nitrógeno líquido (NL2) colocándolas en una rampa de flotación a 4 centímetros (cm) por encima del nivel de NL2 durante 10 minutos (min). Luego fueron sumergidas en el NL2 (-196oC) y almacenadas en un termo para su conservación, de acuerdo a lo detallado por Baracaldo y col. [3]. Un total de 60 pajuelas fueron congeladas (3 pajuelas/ epidídimo) para ambos grupos de almacenamiento de epidídimos T-5 (n = 30) y T-20 (n = 30).
Análisis espermático
Las muestras espermáticas recuperadas fueron evaluadas previamente a la congelación. La motilidad individual progresiva (MIP) fue evaluada subjetivamente por microscopía óptica (CX31®, Olympus®, Japón) con un lente de 20X. La vitalidad espermática (V) y anomalías totales (AT) fueron evaluadas mediante de un frotis después de haber colocado 5 microlitros (µL) de contenido espermático recuperado y 5 µL de eosina-nigrosina en un portaobjetos. El frotis fue observado al microscopio con una lente de 40X, y se contaron 200 células, considerándose vivos a los espermatozoides sin colorear y muertos a los coloreados. Además, la morfología de 200 espermatozoides fue evaluada para determinar el la cantidad anormalidades totales. Los resultados fueron expresados en porcentajes.
Las muestra espermáticas congeladas fueron descongeladas a los 7 días (d) sumergiendo las pajuelas en un baño de agua (Memmert®, WNB 10, Alemania) a 37ºC durante 1 minuto min. La motilidad espermática fue evaluada mediante un análisis de semen asistido por computadora – CASA (SpermVision Production- versión 1.01TM. Verona, WI, EUA) adaptado a un microscopio de contraste de fase (Olympus BX41, Olympus Europa GmbH, Hamburgo, Alemania), una platina térmica, una cámara (Basler camara A301b, Basler AG, Ahrensburg, Alemania) y un adaptador de video (Olympus 0,75 X, Basler AG, Alemania); el sistema fue ajustado y calibrado a una visión estándar para evaluación de semen de toros. Para este propósito, 20 µL de muestras espermáticas descongelada se colocaron en una cámara Leja® de 8 cámaras (Leja Products B.V., Nieuw-Vennep, Paises Bajos) sobre una platina térmica a 38oC. Se evaluaron un mínimo de tres campos y 200 movimientos de espermas a 100 X para cada cámara y muestra. Los parámetros de motilidad evaluados fueron el porcentaje de espermatozoides mótiles (MT; evaluó el total de células en movimiento con relación al total de células contadas), el porcentaje de espermatozoides con movimientos progresivos (MP, evaluó células con desplazamiento hacia delante), el porcentaje de espermatozoides con motilidad local (ML, evalúa células en movimiento circular) y el porcentaje de espermatozoides inmóviles (IS, que evalúa células sin movimiento). La V y AT fueron analizadas con el mismo criterio realizado en la evaluación espermática pre congelación. Además, se evaluó la integridad de la membrana espermática mediante la prueba hipoosmóstica (HOST, Hypoosmotic Swelling Test) colocando 10 µL de semen en 100 µL de una solución hiposmótica (fructosa anhidra: 0,675 g/ L y citrato de sodio: 0,268 g/ L, en agua bidestilada, PO 55 mOsm/ L) según lo descrito por Sánchez y col. [36]. La mezcla se incubó a 37ºC por 45 min, después de lo cual se hizo un frotis para determinar la proporción de células que respondieron positivamente a esta prueba, bajo un aumento de 100X. Se estimó como respuesta positiva a los diferentes grados de curvatura de colas espermáticas realizando un recuento de 200 espermatozoides por muestra y expresando los resultados en porcentaje [20, 35].
Diseño estadístico
Los resultados fueron expresados en promedios + el error estándar de las medias (SEM). Las unidades experimentales en el análisis pre-congelación fueron considerados el líquido espermático recuperado de epidídimos colectados en matadero (n = 20) y las unidades experimentales en el análisis pos-descongelación incluyó las pajuelas congeladas / descongeladas (n = 60). Los valores de las variables espermáticas se distribuyeron normalmente según lo determinó la prueba de Shapiro-Wilk [32]. Se usó un diseño completamente al azar (DCA) y análisis de varianza (ANOVA) de una vía para examinar efecto de dos temperaturas de almacenamiento (grupo T-5 y grupo T-20) de epidídimos antes de la congelación y después de la descongelación sobre los parámetros de calidad espermática. Todos los cálculos fueron realizados usando el software SPSS [19] versión 23.0 (IBM Inc., Chicago , IL, EUA) para Windows.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las diferencias entre los porcentajes de motilidad, viabilidad (V), anormalidades totales (AT) y funcionalidad de la membrana (HOST) de espermatozoides recuperados de epidídimos almacenados a dos temperaturas y evaluados antes de la congelación o después de la descongelación están expuestos en la TABLA I.
En el análisis pre congelación, los porcentaje de MIP, V y AT de los espermatozoides recuperados de epidídimos almacenados a 5ºC (T-5) no mostraron diferencias significativas (P>0,05) con respecto a los valores espermáticos de los epidídimos almacenados a 20ºC (T-20).
En el análisis post descongelación, asimismo los parámetros de motilidad evaluados por el sistema computarizado CASA (por ejemplo MT, MP, ML) así como las AT, no evidenciaron diferencias significativas (P>0,05) entre los valores espermáticos de las dos temperaturas de almacenamiento de epidídimos. Los espermatozoides congelados/ descongelados del grupo T-5 mostraron un porcentaje de V superior (P<0,05) en comparación con el grupo T-20. No obstante, con el grupo T-20 los espermatozoides de los epidídimos descongelados mostraron una mayor porcentaje de HOST en comparación con el grupo T-5.
Los resultados obtenidos en este estudio demostraron que motilidad e integridad morfológica de los espermatozoides recuperados de epidídimos y almacenados a 5ºC no difirieron significativamente de los almacenados a 20ºC. Esta misma tendencia de motilidad fue mostrada después del proceso de congelación/ descongelación. Por lo tanto, los resultados obtenidos sugieren que, aunque la congelación determinada por los parámetros de motilidad e integridad morfológica espermática no es sorprendente, los espermatozoides epididimarios son capaces de sobrevivir a la crioconservación luego almacenar los testículos a 5ºC o 20ºC durante un corto tiempo (por ejemplo 6 h).
El almacenamiento post mortem de testículos de caballos [4, 30], toros [8, 14] y carneros [22] a una temperatura entre 4 a 5ºC por al menos 24 h, ha sugerido de que los espermatozoides mantienen su capacidad de fertilización. La cola del epidídimo es el lugar de almacenamiento y maduración de los espermatozoides antes de la eyaculación, y permite que estas células permanezcan viables durante cierto período de tiempo, y los parámetros de calidad espermática, tales como la motilidad, vitalidad y integridad morfológica dependen de las condiciones fisiológicas de esta estructura [2, 9, 33]. Los resultados del presente estudio están de acuerdo con los obtenidos por Durán y col. [10] quienes sugieren que, las temperaturas bajas de preservación (4°C) de epidídimos no parece mejorar la calidad espermática en comparación con las altas, al menos dentro de un período de 8h.
Estudios previos han demostrado que motilidad y la integridad de las membranas espermáticas (plasmáticas y acrosomal) de espermatozoides recuperados de epidídimos post mortem almacenados a temperaturas de refrigeración (4 o 5ºC), permiten una supervivencia deseable después del proceso de criopreservación [6, 26]. Ribeiro-Peres y col. [34] y Nichi y col. [31] reportaron que los espermatozoides provenientes de la cola del epidídimo conservan mejor su motilidad a bajas temperaturas, debido probablemente a la menor actividad metabólica y la menor tasa de crecimiento de microorganismos a 5oC. En el presente estudio, la V espermática obtenida después del proceso de congelación/ descongelación de espermatozoides epididimarios fue mayor después de ser almacenados a 5 que a 20ºC. Los resultados obtenidos sugieren que los espermatozoides de toro recuperados post mortem luego de un almacenamiento a bajas temperaturas poseen una mayor supervivencia espermática post descongelación en comparación con los espermatozoides de epidídimos almacenados a temperaturas altas. No obstante, este valor no se ve reflejado en motilidad ya que los resultados mostraron parámetros de motilidad similares (por ejemplo MT, MP, ML) en ambas temperaturas de almacenamiento.
Por otro lado, se han desarrollado investigaciones previas usando temperaturas altas de almacenamiento (por ejemplo, sobre los 20ºC) de epidídimos [1, 16, 39], y los hallazgos sugieren que en estas condiciones la motilidad espermática no se ve afectada, obteniendo resultados deseables a la congelación. En la Amazonía Ecuatoriana, que posee un clima tropical húmedo con temperaturas ambientales elevadas, se acelera la descomposición del cadáver (incluyendo los epidídimos) lo que podría afectar la motilidad espermática si aumentase el tiempo de almacenamiento. El tiempo óptimo para almacenamiento de epidídimos post mortem es de 2 h [5], no obstante, el incremento del tiempo de almacenamiento de epidídimos expuestos a temperaturas altas que puede afectar la supervivencia de los espermatozoides. Los resultados obtenidos mostraron que la funcionalidad de la membrana obtenida por la prueba de endósmosis (HOST) fue mayor en espermatozoides descongelados provenientes de epidídimos almacenados a 20ºC que a 5ºC. Por lo tanto, se especula que a los toros muertos durante las primeras 6 h bajo condiciones ambientales trópico húmedas, los espermatozoides del epidídimo conservan mejor la funcionalidad de la membrana plasmática y probablemente, su capacidad de fertilización. Esta misma tendencia, ha sido demostrada por Kaabi y col. [22], aunque el porcentaje de HOST de espermatozoides epididimarios descongelados no difirieron significativamente luego de haber almacenado epidídimos de toros hasta por 48 h.
CONCLUSIÓN
Los resultados sugieren que, a pesar de las controversias encontradas en la integridad (V) y funcionalidad (HOST) de la membrana plasmática luego de la descongelación, los epidídimos de toros sacrificados en condiciones ambientales de la Amazonía ecuatoriana pueden ser almacenados a 5 o 20ºC durante un corto período de tiempo y obtener una motilidad e integridad morfológica post descongelación similar. Sin embargo, se recomienda realizar estudios adicionales para evaluar la capacidad de fertilización de éstos espermatozoides mediante la IA bajo condiciones de campo.
AGRADECIMIENTO
Los autores agradecen a la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Cuenca, a la administración de la hacienda experimental Irquis y a la DIUC (Dirección de Investigación de la Universidad de Cuenca) por colaborar con los recursos humanos y físicos paradesarrollar esta investigación.
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