SISTEMA PCR/DGGE PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS EN EL TORRENTE SANGUÍNEO DE BOVINOS ESTABLECIDOS EN REGIONES GANADERAS DEL ESTADO MÉRIDA, VENEZUELA

PCR/DGGE System for detection of microorganisms in bovine blood stream established in cattle livestock regions of Merida State, Venezuela

Ana María Bolívar1*, Agustina Rojas-Estaba2, Yzoleth Torres3 y Pablo García-Lugo3

1 Investigaciones Parasitológicas “J. M. Rangel”, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela. 2 Investigaciones Parasitológicas “J. F. Torrealba”, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela. 3 Laboratorio de Biotecnología “S. D. Rojo”, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela. * Correspondencia: ambolivar@hotmail.com

RESUMEN

El estudio presenta la detección de bacterias y parásitos en sangre de bovinos, en zonas de ganadería merideña utilizando el procedimiento de biodiversidad genética denominado Sistema de análisis por Electroforesis en Geles con Gradiente Desnaturalizante de amplificados por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR/DGGE). Para tal fin se evaluó el metagenoma sanguíneo de 162 animales (115 Bos taurus y 47 Bubalus bubalis) de condición clínica inaparente, distribuidos en asentamientos ubicados entre 4 y 1947 msnm. Se obtuvo una biodiversidad de 22 microorganismos, destacando en frecuencia, a potenciales patógenos como: Besnoitia besnoiti, Anaplasma marginale, Mycoplasma wenyonii y Ureaplasma urealitycum. La utilización del sistema PCR/DGGE incrementa las posibilidades de diagnosticar agentes infecciosos en sangre, y dado que algunos microorganismos reportados son responsables de significativos daños al bovino, refleja esta ventaja biotecnológica a efectos de intervenciones en campo.

Palabras clave: Ganadería bovina; biodiversidad microbiana; sistema PCR/DGGE

ABSTRACT

The study presents the detection of bacteria and parasites in bovine blood stream, in areas of cattle breeding in the Merida State, using the procedure of genetic biodiversity called Desnaturing Gradient Gel Electrophoresis analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified (PCR/DGGE). For this purpose, the blood metagenome of 162 animals (115 Bos taurus and 47 Bubalus bubalis) of inapparent clinical condition, distributed in settlements between 4 and 1947 msnm were evaluated. Biodiversity of 22 microorganisms was obtained, emphasizing in frequency, to potential pathogens such as: Besnoitia besnoiti, Anaplasma marginale, Mycoplasma wenyonii and Ureaplasma urealitycum. The use of the PCR/DGGE system increases the chances of diagnosing infectious agents in blood, and given that some reported microorganisms are responsible for significant damage to the bovine, it reflects this biotechnological advantage for the purposes of field interventions.

Key words: Cattle breeding; microbial biodiversity; PCR/DGGE system

Recibido: 27/06/2017 Aceptado: 17/11/2017

INTRODUCCIÓN

Algunos de los más importantes agentes microbianos que comprometen la salud del bovino (Bos taurus) se ubican en grupos taxonómicos bacterianos y parasitarios [10]. Dentro de cada grupo existen numerosos géneros, especies y hasta variantes genéticas con patogenicidad variable y distribución geográfica diversa [2, 15, 22, 46], sin embargo, aún permanecen desconocidas, prevalencias e incidencias reales para un número importante de estos agentes, circunstancia que limita la comprensión de la verdadera epizootiología en algunas áreas [11, 23, 39].

El torrente sanguíneo del bovino representa un hábitat significativo así como un potencial vehículo para numerosos microorganismos. De tal modo que el conocimiento de bacterias y parásitos que pueden detectarse en sangre es esencial a efectos de ejecutar intervenciones efectivas en campo tendientes a controlar la aparición de focos de infección y/o enfermedad y evitar o minimizar su posible difusión [11, 33, 36].

La detección tradicional de microorganismos sanguíneos involucra como primera herramienta diagnóstica, el reconocimiento e identificación de los diferentes estadios morfológicos mediante la observación microscópica directa; no obstante, el rango de características diferenciales para algunos microorganismos es limitado o indistinguible [20, 22], constituyéndose junto a la baja carga microbiana en potenciales desventajas.

Frente a esta situación, se presentan variantes del método molecular entre las que se cita la técnica de marcaje o huella genética Electroforesis en Geles de Gradiente Desnaturalizante (DGGE por sus siglas en inglés) [17, 18, 37, 38], procedimiento que ha contribuido considerablemente en la determinación y el entendimiento de la diversidad de poblaciones microbianas en el tiempo y espacio [12, 37]. El procedimiento requiere la amplificación previa de un gen altamente conservado entre especies, mediante una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en la que se utiliza un cebador con una pinza-GC que evita la disociación por completo de la doble hélice de ADN a medida que un amplicón es corrido en un gel de acrilamida con un gradiente desnaturalizante [17, 18]. De tal modo que al analizar el ADN de una población microbiana, el resultado que se obtiene son múltiples copias del gen diana (gen concreto identificativo a detectar) de todos los microorganismos presentes en esa población. Finalizada la electroforesis, las bandas resultantes se pueden identificar por comparación con bandas generadas por cepas patrón o aislar y purificar el ADN para secuenciarlo [7, 50].

La utilización del sistema PCR/DGGE en la detección de la diversidad microbiana del ambiente sanguíneo del bovino puede contribuir a aumentar las posibilidades diagnósticas más allá de los hemotrópicos considerados habitualmente patógenos. Junto a esta capacidad discriminatoria, se podría inducir potenciales panoramas de riesgo en poblaciones animales susceptibles a

otros microorganismos, fortaleciendo de este modo los campos clínicos, epizootiológicos y de investigación. Dadas estas circunstancias, se pretendió detectar poblaciones bacterianas y parasitarias en sangre de bovinos utilizando el sistema PCR/ DGGE y valorar los hallazgos obtenidos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población y muestra biológica

Bovinos (Bos taurus) y búfalos (Bubalus bubalis) de condición clínica inaparente y provenientes de diversos asentamientos del estado Mérida, Venezuela, ubicados en Zona de Ganadería Alta (ZGA) y Zona de Ganadería Baja (ZGB) fueron incluidos en la investigación. Los bovinos fueron inmovilizados para la obtención de sangre por venopunción (yugular), teniendo en cuenta las normas técnicas en el manejo y sujeción de animales referente a los principios éticos internacionales para la investigación biomédica y preservación del material biológico. En cada animal se utilizó inyectadora estéril descartable en sistema vacutainer® y recolección sanguínea en tubos estériles con el anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético EDTA (2 mg/mL), conservando los procedimientos recomendados habitualmente de manipulación y mantenimiento de las muestras hasta su llegada al laboratorio.

Obtención del metagenoma sanguíneo

Una alícuota de 400 μL de sangre homogeneizada fue depositada en tubo cónico de centrífuga añadiendo igual volumen de buffer de lisis (Tris-base grado biología molecular [10 mM], NaCl [150 mM], agua estéril capacidad suficiente para 500 mL, pH 7,5) y 5 μL de proteinasa K (concentración final 20 mg/mL). Esta mezcla se incubó (Memmert, 800, Memmert, Alemania) a 65 °C durante dos horas (h), seguido de una nueva incubación durante 15 minutos (min) / 100 °C y posteriormente centrifugar (Eppendorf, 5415D, Eppendorf, Alemania) a 15000 g / 15 min. El sobrenadante fue trasvasado a un tubo cónico de centrifuga para proseguir con la extracción v/v fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitación con etanol. El metagenoma obtenido de cada muestra fue diluido en 70 μL de agua MilliQ y mantenido a -20 ºC (Frigidaire, Frigidaire-vertival, Electrolux, Suecia) hasta su uso.

Reacciones PCR/DGGE

Las comunidades bacterianas fueron estudiadas según Muyzer y col. [37] TABLA I y las comunidades parasitarias por la metodología de Baré y col. y Díez y col. [4, 14] TABLA II.

TABLA I

DETECCIÓN DE BACTERIAS EN SANGRE DE BOVINOS. PROTOCOLO PCR/DGGE

TABLA II

DETECCIÓN DE PARÁSITOS EN SANGRE DE BOVINOS. PROTOCOLO PCR/DGGE

Una primera reacción PCR/DGGE se realizó en volumen final 25 µL (cebadores libres de pinza-GC), utilizando concentración de reactivos y condiciones de ciclaje señalados por los autores. Cada producto amplificado fue verificado por electroforesis en gel de agarosa, coloración con Bromuro de Etidium (BrEt) y marcador de peso molecular. Evidenciada la presencia de bandas, se procedió a una reacción secundaria PCR/DGGE en volumen final 100 µL (cebadores con pinza-GC). Comprobada la amplificación, el producto restante fue precipitado con acetato de potasio (7,5 M, pH 7,5 [3,3 μL / 50μL de reacción]) y 2 volúmenes de isopropanol en frio durante 12 h, sometido a centrifugación (12000 g / 10 min), lavado con etanol 70 % y finalmente resuspendido en 20 μL de buffer de carga.

Condiciones de corrida DGGE

La corrida se efectuó durante 12 h a 100 voltios y temperatura constante de 60 °C en un equipo para DGGE Bio-Rad C.B.S. Scientific, EUA, utilizando geles de acrilamida de 16x16 cm x 1 mm al 8 % (acrilamida: bis-acrilamida 37:5:1 [v/v]), con un gradiente químico de desnaturalización creciente 40 a 80 % (obtenido de una mezcla de urea [7 M] y formamida [40 %] en 100 % desnaturalizante) [6].

Finalizada la electroforesis, los geles se colorearon con BrEt, visualizaron bajo luz ultravioleta (LUV) y se comparó la eficacia de la corrida empleando patrones de peso molecular.

Producto esperado

En el gel se observaron una o varias bandas (nombradas como Unidades Taxonómicas Operacionales [OTU’s por sus siglas en inglés]). El ADN de estas bandas se extrajo mediante el método de difusión en agua desionizada estéril [14, 19]. En este sentido,

las bandas-ADN se cortaron y mantuvieron a 4 °C en tubos cónicos conteniendo 50 μL de agua MilliQ estéril. Bajo estas condiciones, el ADN eludido se amplificó en volumen final 25 μL, tomando 1 μL para su visualización en geles de agarosa (2 %). El volumen restante fue empleado para purificación adicionando acetato de amonio (v/v, 10 M) y etanol absoluto en frío. La mezcla fue incubada a -20 °C / 24 h y centrifugada a 15000 g / 20 min, decantando el sobrenadante y limpiado el ADN con etanol 70

% (v/v). El ADN se resuspendió en 15 μL de agua MilliQ estéril y 12 μL fueron enviados (siguiendo las recomendaciones para la preservación del ADN), a la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (UEGF-IVIC) para su secuenciación.

Identificación de patrones de banda resultantes por PCR/DGGE a diferentes escalas taxonómicas mediante herramientas bioinformáticas

Obtenido el reporte de secuencias, se procedió a realizar el análisis de similitud utilizando las herramientas bioinformáticas del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), de manera que se pudo predecir la identidad de los microorganismos problemas por comparación del porcentaje de identidad con las secuencias reportadas en esta base de datos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En total fueron evaluados 162 bovinos, distribuidos en 16 fincas de 6 municipios del estado: Libertador (L), Campo Elías (CE), Sucre (S), Alberto Adriani (AA), Obispo Ramos de Lora (ORL) y Caracciolo Parra Olmedo (CPO) (TABLA III, FIG. 1).

TABLA III

INFORMACIÓN DE LAS FINCAS GANADERAS EVALUADAS

Nº: número asignado a la finca, ZG: zona ganadera de procedencia, M: municipio, PobVacEv: población vacuna evaluada, PobBufEv: población bufalina evaluada.

FIGURA 1. DISTRIBUCIÓN DE LOS SISTEMAS GANADEROS EVALUADOS DENTRO DE LOS MUNICIPIOS DEL ESTADO MÉRIDA. ZGA: L, CE Y S. ZGB: AA, ORL Y CPO. LÍNEA PUNTEADA: DIVISIÓN TERRITORIAL DE LAS ZONAS GANADERAS.

Se contabilizaron 115 B. taurus (92 en ZGA y 23 en ZGB) y 47 B. bubalis (todos en ZGB). En fincas de la ZGA, el vacuno fue la única especie productora, mientras que en la ZGB además de explotaciones mixtas vacuno/bufalino se presentaron fincas con sistema de explotación vacuno/bufalino/ovino (B. taurus/B. bubalis/Ovis aries) y vacuno/bufalino/ovino/porcino (B. taurus/B. bubalis/O. aries/Sus scroffa domesticus).

La predicción de microorganismos bacterianos se contabilizó en n=19, de las cuales 9 (47,4 %) han sido referidas como potenciales patógenos, mientras que las tres comunidades parasitarias reportadas han sido referidas como patógenas (TABLA IV).

TABLA IV

PREDICCIÓN MICROBIANA CON POTENCIAL PATÓGENO REPORTADO EN METAGENOMA SANGUÍNEO DE BOVINOS

( ) % similitud

En B. bubalis, la máxima identidad por metagenoma incluyó: Besnoitia besnoiti, Anaplasma marginale, Mycoplasma wenyonii, Acinetobacter spp., Brucella melitensis y Ureaplasma urealyticum; y en B. taurus estuvo representada por: A. marginale, M. wenyonii, Arthobacter spp., Azotobacter vinelandi, Pseudomonas aeruginosa y U. urealyticum. Los hallazgos de

identidad múltiple por metagenoma revelaron predicción de comunidades bacterianas sin potencial patógeno (TABLA V). Adicional, se reportó un 4,3 % (7/162) de bacterias no cultivables y un 9,9 % (16/162) de bandas OTU´s sin similitud (ausencia de reporte en la base de datos del Blast-NCBI para esa secuencia).

TABLA V

PREDICCIÓN BACTERIANA SIN POTENCIAL PATÓGENO EN METAGENOMA SANGUÍNEO DE BOVINOS

( ) % similitud

En comparación a los procedimientos de frotis sanguíneo coloreado, microcentrifugación y la técnica PCR que también fueron ejecutados, el sistema PCR/DGGE arrojó negatividad en la predicción de especies del género Trypanosoma así como baja frecuencia para A. marginale y B. bovis (datos no mostrados).

La tecnología PCR/DGGE en el campo veterinario comenzó a ser aplicada para la diferenciación taxonómica en grupos parasitarios como Eimeria y Cryptosporidium así como para algunos protozoarios de vida libre [5, 34]. Al presente, ha sido ensayada para determinar la complejidad bacteriana en diversos modelos animales a partir de muestras de rumen [9, 21, 27, 42, 43, 52], contenido estomacal, ileocecal o de heces

[1, 24, 41, 55, 56], cavidad uterina [47], tracto respiratorio [40] y mucosas corporales como vaginal, ocular y nasal [48]. En cuanto a la determinación de microorganismos parasitarios, se citan las experiencias en rumen para bovinos y ovejos [26, 44, 49, 51] y contenido ileocecal de aves [53]. La utilización de esta herramienta biotecnológica de diversidad microbiana a partir del metagenoma obtenido de sangre de bovinos, permitió evidenciar hemotrópicos no considerados tradicionales en la ganadería bovina nacional, tal es el caso de especies pertenecientes a los géneros Mycoplasma y Besnoitia, así como hacer manifiesta la detección de otros patógenos cuando realizan transito hemático

(B. melitensis, U. urealyticum, P. aeruginosa, Acinetobacter spp.,

Propionibacterium spp. y Corynebacterium spp.).

M. wenyonii ha sido descrito en bovinos como agente etiológico de un síndrome anemizante caracterizado por linfoadenopatías, pirexia y repercusión en sistemas cardíaco y reproductor, además de afectación en la producción lechera. A pesar de que ha sido incriminada la transmisión mecánica por Stomoxys, Tabanus, Culex y Haematobia y experimentalmente comprobada la transmisión transplacentaria, aún son desconocidos aspectos como prevalencias y rutas de transmisión. El diagnóstico directo de M. wenyonii puede presentar confusión con A. marginale y Ehrlichia [23, 31, 36], de tal modo que los procedimientos moleculares como el sistema PCR/DGGE resultan de confiabilidad en la detección de este agente.

B. besnoiti presenta a bóvidos domésticos y silvestres como hospedadores intermediarios. Es responsable de la besnoitiosis bovina, enfermedad considerada re-emergente y clínicamente caracterizada por la sucesión de tres fases, las dos primeras asociadas a la proliferación de endozoitos en vasos sanguíneos con signos como cuadro febril, anorexia, fotofobia, aumento de secreción nasal/ocular, incremento de la frecuencia cardiorrespiratoria, edema generalizado y adenopatías. Al presente, el ciclo de vida no está totalmente

comprendido por desconocimientos del hospedador definitivo y rutas de transmisión, aunque es posible la transmisión mecánica por Stomoxys calcitrans (ADN parasitario ha sido detectado en piezas bucales y contenido estomacal del vector). B. besnoiti se reporta como responsable de brotes al noreste de Europa y en países como Portugal, España y Francia [3, 25, 29, 30] y a pesar de no existir reportes vigentes de bovinos con infección activa en Suramérica [29], pudiera suponerse que su expansión a esta área, incluyendo Venezuela es posible. En la ganadería bovina nacional, B. besnoiti fue mencionado por ver primera por Vogelsang y Gallo [54], sin embargo hasta donde fue posible indagar, no se encontró referencia actualizada de su presencia, situación que pone de manifiesto su carácter re-emergente.

U. urealyticum se relaciona a un amplio espectro de enfermedades, algunas asociadas al sistema reproductivo del bovino, de tal modo que es importante un diagnóstico oportuno a fin de iniciar una terapia que prevenga las complicaciones y secuelas de la infección [8, 28]. B. melitensis ha sido señalada como responsable de abortos en pequeños animales principalmente cabras (Capra hircus) y ovejos, sus hospedadores primarios naturales [13] y su detección en bovinos pudo ser consecuencia de la circulación del microorganismo en ganaderías mixtas.

P. aeruginosa y los géneros Acinetobacter, Propionibacterium y Corynebacterium están asociados a mastitis [32]. El género Acinetobacter se reporta en procesos de mastitis bovina multirresistente y formación de biofilms dentro del canal del pezón o equipos de ordeño, complicando más su tratamiento y prevención, por lo cual su temprana detección ayudaría a mejorar las maniobras de prevención y los abordajes de tratamientos [45].

El sistema PCR/DGGE ofrece ventajas frente a técnicas convencionales como la independencia de cultivo, el realizar un seguimiento temporal/espacial de comunidades microbianas en diferentes ambientes y la oportunidad de detectar infecciones inaparentes. Sin embargo, al igual que cualquier técnica analítica presenta inconvenientes [16, 35, 38, 45] como la co-migración y la obtención de bandas de baja intensidad que limitan el proceso de secuenciación y por ende, la capacidad de identificación [45]. Estos inconvenientes pudieran explicar la no correlación del sistema con técnicas como la PCR o procedimientos directos (datos no revelados).

Las repercusiones negativas en la producción animal de algunos microorganismos reportados en esta investigación, cuando se manifiestan como infecciones inaparentes, generalmente son observadas a largo plazo (calidad y cantidad de los productos obtenidos). La actual crisis económica en Venezuela sorprende a la nación en un momento en el que todas las razas ganaderas, inclusive los animales que gozan de buena condición genética están bajo riesgo de infección microbiana. Aunado, la escasa documentación en la literatura nacional para algunos de los microorganismos reportados en este estudio promueven el pensamiento sobre la circulación inaparente que puede ser extrapolada a las explotaciones ganaderas del

resto del país, creando escenarios alarmantes si se considera la posibilidad de que un animal subclínico pudiera aflorar condición clínica patente.

CONCLUSIONES

Microorganismos de interés bovino se predicen en sistemas ganaderos de zonas de vida complejas del estado Mérida, Venezuela, señalando la ventaja diagnóstica de la metodología molecular en la comprensión epizootiológica y el riesgo latente en animales inaparentes al considerar los factores socio-económicos- políticos actuales que impactan en la productividad ganadera.

Se considera necesario a nivel de campo, la utilización en conjunto de la metodología PCR/DGGE a otro procedimiento diagnostico, así como proseguir con las investigaciones empleando la metodología propuesta a un mayor número de animales.

AGRADECIMIENTO

Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico, Tecnológico y de las Artes de la Universidad de Los Andes (CDCHTA-ULA) bajo el Proyecto: FA-582-15-03-B, por el financiamiento otorgado.

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Vol, XXVIII, N° 1

Esta revista fue editada en formato digital y publicada en febrero de 2018, por el Fondo Editorial Serbiluz, Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela

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