Depósito Legal ppi 201502ZU4668
Vol. 25, No 3, 4
Julio - Diciembre 2017
An International Refereed Scientic Journal
of the Facultad Experimental de Ciencias
at the Universidad del Zulia
Esta publicación cientíca en
formato digital es continuidad
de la revista impresa
Depósito Legal: pp 199302ZU47
ISSN: 1315-2076
Scientic Journal from the Experimental Faculty of Sciences,
at the Universidad del Zulia Volume 25 Especial N° 3, 4, Julio - Diciembre 2017
CIENCIA 25 (3,4), 113 - 119, 2017
Maracaibo, Venezuela
Composición química y actividad antibacteriana preliminar
del aceite esencial de las hojas de Lippia schlimii
Néstor Peña*, Dinorah Ávila, José G. Ortega F.
Laboratorio de Productos Naturales. Departamento de Química, Facultad Experimental de Ciencias,
Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela
Recibido: 19-07-2017 Aceptado: 11-09-2017
Resumen
El aceite esencial obtenido por hidrodestilación de las partes aéreas de Lippia schlimii se analizó por
Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG/EM). Se identicaron aproximadamente 33
componentes, de los cuales los mayoritarios fueron: Linalool-L (2,96%), Benzeneethanol (2,77%), Terpineol-4
(2,25%), α-Guaieno (4,59%), α-Amorfeno (3,39%), δ-Cadineno (5,01%), Germacreno (2,9%), α-Cadinol
(2,45%), T-Cadinol (4,19%) y 1-hidroxilinalool (31,26%). Se evaluó la actividad antibacteriana del aceite
esencial por el método de difusión en agar con pozos, y de la concentración mínima inhibitoria (CMI) frente
a Staphylococcus aereus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Micrococcus sp, Bacillus subtilis
(Gram +), Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomona aeruginosa ATCC 27853, Serratia marcescens, Proteus
vulgaris y Enterobacter cloacae (Gram -). Los resultados muestran que el aceite inhibió el desarrollo de S.
aureus, Serratia marcescens y Micrococcus sp, a una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 300 µg/ml,
y de B. subtillis de 200 µg/ml.
Palabra claves: Lippia schlimii, Verbenácea, aceite esencial, actividad antibacteriana.
Chemical composition and preliminary antibacterial activity of the
essential oil of the leaves of Lippia schlimii
Abstract
The essential oil obtained by hydrodistillation of the leaves of Lippia schlimii, was analyzed by gas
chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Approximately 33 compounds were identied,
of which the majority were Linalool-L (2,96%), Benzeneethanol (2,77%), Terpineol-4 (2,25%), α-Guaiene
(4,59%), α-Amorphene (3,39%), δ-Cadinene (5,01%), Germacreno (2,9%), α-Cadinol (2,45%), T-Cadinol
(4,19%) and 1-hydroxylinalool (31,26%). The antibacterial activity of essential oil was evaluated by the agar
diffusion method and minimum inhibitory concentration (MIC), against Staphylococcus aereus ATCC 25923,
Enterococcus faecalis ATCC 29212, Micrococcus sp, Bacillus subtilis (Gram +), Escherichia coli ATCC 25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae (Gram
-). The results show that the oil inhibited the development of S. aureus, S. marcescens and Micrococcus sp., at
a minimum inhibitory concentration (MIC) of 300 µg/ml and B. subtillis 200 µg/ml.
Key Words: Lippia schlimii; Verbenácea; essential oil; antimicrobial activity.
* nestorspa@hotmail.com
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Introducción
El hombre ha aprovechado las virtudes aromáticas
de las plantas. Los aceites esenciales extraídos de
ellas han servido de base para la aromatización de
postres, guisos y para la elaboración de perfumes,
remedios y medicamentos.
Los aceites volátiles son mezclas muy
complejas de compuestos, generalmente
constituidos mayoritariamente por monoterpenos
y sesquiterpenos; de hecho, se ha estimado
la presencia de más de 1000 monoterpenos y
3000 sesquiterpenos en los aceites esenciales de
diversas plantas. Otros tipos de compuestos que se
encuentran en los aceites son los hidrocarburos de
formula general (C
5
H
8
)n y compuestos oxigenados
derivados de dichos hidrocarburos, tales como
alcoholes, aldehídos, ésteres, éteres, cetonas, fenoles
y óxidos (1).
La familia Verbenácea está constituida por
una amplia variedad de plantas principalmente
de árboles tropicales, dentro de éstas, el género
Lippia (Verbenácea) comprende alrededor de
200 especies las cuales han sido estudiadas con
insistencia debido a la marcada variabilidad que
presenta la composición de sus aceites esenciales,
estrechamente ligada a la diversidad de acciones
farmacológicas (2). L. alba (Mill.) N. E. Br. es una de
las especies más estudiadas hasta los momentos; su
aceite esencial contiene componentes que pueden
considerarse como marcadores quimiotaxonómicos
(3),
los cuales permiten su identicación botánica.
Es utilizada popularmente para el tratamiento de
estados gripales, en casos de afecciones estomacales,
disfunciones digestivas, también se utiliza como
tónico y antirreumático, además posee propiedades
antiinamatorias y anti-ulcerogénicas (3, 4).
El valor comercial y el uso de los aceites
dependen básicamente de su composición química,
la cual a su vez está condicionada por diversos
factores de tipo botánico y agrícola, entre otros. La
clasicación de los constituyentes en función del
contenido presente en cada esencia es fundamental
tanto para determinar la calidad de la esencia, como
para precisar sus características organolépticas, sus
efectos siológicos y/o actividad biológica.
Algunas especies estudiadas del género son L.
grandis (5),
L. integrifolia (6-11), L. javanica (12-
14),
L. junelliana (15, 16), L. laxibracteata (17), L.
lupulina (18), L. palmieri (19), L. stoechadifolia (20),
L. triphyla (21), L. polystachya (22), L. turbinata
(22, 23) y L. uckambensis (24),
las cuales han
demostrado poseer gran variedad de compuestos
terpenoidales, especícamente sesquiterpenos, así
como actividad antimicrobiana y antiviral entre
otras. Algunas de ellas también presentan actividad
antiinamatoria, analgésica y antipirética en sus
extractos foliares y parecen ser los terpenos los
responsables de dichas propiedades (25, 26).
En
base a los antecedentes antes mencionados, resulta
de gran interés el estudio de la composición química
del aceite esencial de la especie L. schlimii, así como
también determinar la actividad antibacteriana por
parte de dicho aceite.
Materiales y Métodos
Tratamiento del material Vegetal.
La especie L. schlimii fue localizada en El Cobre,
municipio José María Vargas del Estado Táchira, a
unos 2300 m de altitud. El vegetal fue recolectado
e identicado por el Dr. Miguel Pietrangeli, del
Laboratorio de Plantas Vasculares de la Facultad
Experimental de Ciencias de la Universidad del Zulia
en febrero de 2009. Se realizó un muestreo del tipo
aleatorio sobre especies silvestres, hasta obtener la
cantidad necesaria de material vegetal. El material
recolectado (hojas), se dejó secar bajo sombra a
temperatura ambiente durante varios días, luego se
molió namente hasta obtener 0,5 Kg. de material
seco y molido.
Obtención del aceite esencial
Las hojas molidas se sometieron a
hidrodestilación, colocando porciones de 150 y 200
g de las mismas con 1000 mL de agua destilada. Se
reunieron los destilados y se separó el aceite de la
fase acuosa con cloroformo y se secó con sulfato
de sodio anhidro. El aceite obtenido (0,5 mL) se
guardó en un frasco ámbar y se refrigeró a 4 ºC por
aproximadamente 5 días, hasta su posterior análisis.
Cromatografía de gas (CG)
La composición porcentual del aceite se
determinó por el método de normalización de área
de pico. El análisis se realizó en un cromatógrafo
de gas Perkin-Elmer, con detector FID y sistema
de data-handling. Se inyectó 1.0 µL con relación de
split de 10:1, el gas de arrastre fue helio a 0.8 mL/
min. La temperatura del inyector y detector varió de
200 a 280 ºC. Se utilizó una columna capilar HP-5,
de sílice fundida a 5% de fenilmetilpolisiloxano (30
m x 0.25 mm d.i, con un grosor de película de 0.25
µm); la temperatura fue programada desde 60 a 260
ºC con una rampa de 4 ºC/min.
Análisis químico del aceite esencial (CG-MS)
El análisis del aceite esencial se realizó mediante
cromatografía de gases acoplada a espectrometría
de masas en un cromatógrafo de gases Hewlett
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Packard HP 6890 acoplado a un detector de masa
Hewlett Packard modelo 5973, equipado con una
columna HP-5MS de sílice fundida (30 m x 0.25
mm d.i, con un grosor de película de 0.25 µm). La
temperatura de la cámara de ionización y de línea de
transferencia fue de 150 a 280 ºC; el gas de arrastre
fue helio ajustado a una velocidad lineal de 34 cm/s.
La energía de ionización fue de 70 eV. Los espectros
de masa se obtuvieron por barrido automático en el
rango de m/z 20-400 u.m.a, a 3.9 scan/s.
La identicación de los componentes se basó en
la comparación computarizada de sus espectros de
masas con los de las librerías Wiley MS Data y NIST,
además de los descrito por Adams (27), así como por
la comparación de sus índices de retención con los
datos de la literatura (28).
Actividad antibacteriana
Se realizaron estudios de susceptibilidad
antimicrobiana, sobre bacterias de interés
clínico, utilizando el método de difusión en
pozo.
29
Seguidamente se realizaron ensayos de
concentración mínima inhibitoria (CMI), para los
cuales se seleccionaron las bacterias que resultaron
ser más susceptibles al aceite, en el ensayo de
difusión, utilizando la técnica de micro dilución
en caldo; se emplearon 9 cepas bacterianas Gram
positivas y Gram negativas del tipo ATCC y otras
provenientes de aislados clínicos: Staphylococcus
aereus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC
29212, Micrococcus sp., Bacillus subtilis (Gram
+), Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomona
aeruginosa ATCC 27853, Serratia marcescens,
Proteus vulgaris, Enterobacter cloacae (Gram -),
proporcionadas por la sección de bacteriología del
Hospital Universitario de Maracaibo Venezuela.
Para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana,
se utilizó agar Müller-Hinton (Difco) como medio
de cultivo; se prepararon inóculos en caldo nutritivo
(Becton Dickinson) para cada una de las especies
bacterianas, la concentración del inóculo osciló
entre 107-108 UFC mL
-1
. Luego de ser inoculadas
y de adicionar 20 µL del aceite esencial en cada
pozo, las placas fueron incubadas a 37 ºC durante
18-24 horas; transcurrido este tiempo se procedió
a la medida del halo de inhibición. Los ensayos se
realizaron por triplicado y fueron comparados con
antibióticos comerciales. El aceite se disolvió en una
solución etanol/agua 9:1, (esta solución se utilizó
como control negativo y no presentó efecto alguno
sobre el crecimiento bacteriano).
La determinación de la concentración mínima
inhibitoria (CMI) se realizó utilizando una
modicación del método descrito por Pino A. y col.
(30), en un rango de concentraciones de 10–500
mg/L; la concentración del inóculo osciló entre
107-108 UFC mL
-1
. Los tubos con las diluciones
del aceite, después de expuestos a las bacterias, se
incubaron a 37 ºC durante 18–24 horas, transcurrido
este tiempo se midió la transmitancia a 580 nm,
Vera y col., (31), en un espectrómetro UV PERKIN
– ELMER. En aquellos casos donde se observó
inhibición se tomaron alícuotas y se sembraron en
medios agarizados, para corroborar que no existiera
crecimiento bacteriano, determinándose entonces
el valor de la CMI para cada microorganismo,
denida como la menor concentración del agente
antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento
bacteriano. Se realizaron controles con los solventes
utilizados para diluir la muestra (etanol/agua 9:1)
Resultados y discusión
Composición del aceite esencial de L.
schlimi.
A partir de 0,5 Kg de hojas secas y mediante
hidrodestilación se obtuvo el aceite esencial de
coloración rojiza (0,52 g) con un rendimiento de 0,1
% m/m. En la tabla 1, se muestran los componentes
del aceite detectados por CG-EM de acuerdo al orden
de elución y cuyas concentraciones relativas fueron
mayores a 0,5 % con un porcentaje de conabilidad
mayor o igual a 90 %; así como los índices de
Kovats (IK). El IK es un término que relaciona los
componentes y tiempos de retención del aceite
esencial con una serie de n-paranas multiplicados
por 1000 que tendrían un tiempo de retención
ajustado idéntico al del pico de interés cuando es
analizado sobre condiciones idénticas, ayudando a
identicar positivamente los componentes de una
mezcla (32, 33).
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El componente mayoritario del aceite presentó
una concentración relativa de 31,26 %, su estructura
corresponde al 1-1-hidroxilinalool, la correlación
obtenida para este componente fue de 90 % (se
realizaron comparaciones con las diferentes bases
de datos), otros componentes presentes en el
aceite resultaron ser los sesquiterpenos, Linalool
(3,0 %), Benzeneethanol (2,8 %), Terpineol-4 (2,3
%), α-Guaieno (4,6%), α-Amorpheno (3,4 %),
d-Cadineno (5,0 %), Germacreno (3,0 %), α-Cadinol
(2,5 %), T-Cadinol (4,2%), los cuales se han
encontrado en proporciones similares en aceites de
otras especies del género Lippia, como L. alba (34,
3),
L. integrifolia (6, 11), y Lippia junelliana
(15) por
nombrar algunas. Los resultados obtenidos fueron
diferentes a los reportados por Yáñez y col. (35)
en el 2006, realizados a la misma especie ubicada
al norte de Santander (Colombia), y que crece de
forma silvestre a la misma altitud y temperatura;
en dicho estudio se identicaron 16 componentes,
de los cuales solo 4 (β-Bourboneno, β-Carioleno,
Aromadendreno y óxido de carioleno), están
presente en el aceite de la especie venezolana.
Por su parte el componente mayoritario del aceite
para la especie cultivada en Colombia resultó ser
Germacreno D (21%) el cual diere totalmente al
componente mayoritario encontrado en este estudio.
Estos resultados indican una notable diferencia
Tabla 1. Componentes del aceite esencial de Lippia schlimii
Nº Componente Área
IK
cal.
IK
ref.
1 1-hexanol 0,74 865 870
2 Benzaldehído 0,63 963 960
3 Octenol 0,79 978 979
4 Benzenometanol 0,98 1036 1031
5 Linalool- L 2,96 1100 1096
6 Benzeneethanol 2,77 1117 -
7 Terpineol-4 2,25 1184 1177
8 β-Bourbeneno 1,13 1390 1388
9 β-Elemeno 2,4-diisopropenil-1-metil-1-vinil-ciclohexano 0,91 1397 1390
10 β-Caioleno 1,35 1428 1421
11 α-Guaieno 4,59 1449 1439
12 α-Humuleno 1,67 1465 1454
13 Aromandendreno 1,72 1473 1441
14 α-Amorfeno 3,39 1489 1484
15 Pseudowiddreno 0,89 1496 1498
16 β-Selineno 2,04 1499 1490
17 Valenceno 1,53 1507 1496
18 α-Muuroleno 1,16 1513 1500
19 β-Bisaboleno 2,62 1520 1505
20 Gamma.Cadineno 2,14 1526 1513
21 7-epi-alfa-Selineno 2,72 1530 1522
22 δ- Cadineno 5,01 1535 1523
23 Germacreno 2,9 1546 1557
24 Selina-3,7(11)-dieno 1,68 1552 1546
25 Nerolidol 1,46 1558 1561
26 (-)-Caryoleno óxido 1,26 1588 1583
27 γ-Eudesmol 1,09 1618 1629
28 α-Cadinol 2,45 1623 1635
29 T-Cadinol 4,19 1630 1640
30 1-hidroxilinalool 31,26 1638 -
31 4,4-diuoro-3-metoxibifenilo 1,41 1646 -
32 trans-alfa-bisaboleno 1,45 1689 1680
33 Fitol isómero 1,1 2106 2102
IK cal (HP5): Índice de Kovats calculado, Columna HP-5MS.
IK ref. (HP5): Índice de Kovats de referencia, Columna HP-5MS.
27,28
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en la composición del aceite esencial para ambos
vegetales, hecho que se observa en otras especies del
género Lippia tal es el caso L. alba, L. origanoide,
L. multiora y L. sidoides, cuyos componentes
principales del aceite esencial varían de una planta
a otra dentro de la misma especie, característica que
es utilizada para diferenciarlas como quimiotipos
De acuerdo a los resultados obtenidos en este
trabajo se puede decir que ambos vegetales dieren
en la composición del su aceite esencial por lo que
se está en presencia de un nuevo quimiotipo para la
especie Lippia schlimi correspondiente a la especie
que crece en territorio Venezolano.
Actividad antimicrobiana del aceite esencial
de L. schlimi
Se realizaron ensayos de susceptibilidad
antibacteriana mediante el método de difusión en
pozo, para lo cual se utilizaron 9 cepas bacterianas
evidenciándose actividad en 4 de las nueve cepas
estudiadas. Como se aprecia en la tabla 2, los halos
de inhibición obtenidos fueron inferiores a los de
sus respectivos controles. Sin embargo, se evidencia
propiedad antibacteriana sobre cepas tanto Gram
positivas como Gram negativas, por lo que se
procedió al estudio de la concentración inhibitoria
mínima.
Tabla 2. Actividad antibacteriana in vitro
de los extractos de Lippia schlimii y antibióticos
comerciales (Promedio del halo de inhibición en
mm).
Cepas
Aceite
esencial
Antibióticos
20µl G S C Cf Nx
E. coli
(ATCC 25922)
- 20 20 29 29 31
S. aureus
(ATCC 25923)
11 20 16 33 25 21
Ps. aeruginosa
(ATCC 27853)
- 19 19 - 29 32
S. marcescens 10 27 23 29 33 34
P. vulgaris - 23 20° 17 38° 34°
Microccocus sp. 9 38 - 40° 28 10°
Bacillus subtilis 11 32 16° 15 35 31
E. faecalis
(ATCC 29212)
- - - - 21 18
E. cloacae - 22 20 27 35 35
G: Gentamicina; S: Estreptomicina; C: Cloranfenicol; Cf:
Ciprooxacina; Nx: Noroxacina,
─ No se observó inhibición. ° Algunas colonias resistentes.
La CMI, se realizó utilizando un rango de
concentración de 10-500 µg/mL sobre las cepas
activas al ensayo de susceptibilidad. En la tabla
3, se inere que el aceite de L. schlimi, evidenció
actividad de amplio espectro al inhibir bacterias
Gram positivas y Gram negativas, pues resultó activo
sobre cuatro de las cepas estudiadas, S. aureus,
Micrococcus sp, Gram + y S. marcescens Gram –,
a CMI de 300 µg/mL, respectivamente para cada
cepa. La cuarta cepa, más susceptible, fue B. subtilis
a 200 µg/mL, el efecto obtenido por parte del aceite
no fue comparable con los antibióticos Ampicilina y
Estreptomicina, probablemente porque algunas de
estas bacterias presenten mecanismos de resistencia
adquiridos al ser aislados clínicos, generando la
diferencia en ecacia con respecto a los controles
positivos; sin embargo otras especies del mismo
género, como L. chevalieri (36), L. javanica (12, 13),
L. gracillis
(37)
han mostrado efectos comparables a
los obtenidos, en este trabajo, presentando CMI por
encima de 200 µg/mL. En tal caso es importante
resaltar que este es el primer estudio de actividad
antibacteriana para esta especie, y que componentes
como el linalool, hidroxilinalool, cadinol, por
nombrar algunos, pueden ser los responsables de la
actividad antibacteriana del aceite bajo estudio, lo
que la convierte en un potencial agente bactericida
(38).
Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria in
vitro (CMI) del aceite esencial de L. schlimi.
MIC (µg/mL)
Microorganismo
Aceite
esencial
Ampici-
lina
(Amp)
Estrepto-
micina
(S)
S. aureus
(ATCC 25923)
300 10 10
S. marcescens
(aislado clínico)
300 35 20
Microccocus sp
(aislado clínico).
300 30 25
B. subtilis
(aislado clínico)
200 15 10
Agradecimientos
Los autores agradecen al FONACIT y al CONDES,
proyecto CC-0558-08 por el nanciamiento de este
trabajo.
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Esta revista fue editada en formato digital y publicada
en diciembre de 2017, por el Fondo Editorial Serbiluz,
Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela
Vol.25 Nº3, 4