ISSN2477-9458
BOLETÍN DEL
CENTRO DE
INVESTIGACIONES
BIOLÓGICAS
Dimensiones foliares y fotosíntesis de Rhizophora mangle en
áreas estuarinas bajo condiciones hidrológicas
contrastantes.
Flora Barboza y Ernesto Medina…………………………………….
158
Unpublished species of aquatic beetles of the genus Anacaena in
the Upper Apure, Venezuela (Hydrophilidae:
Chaetarthriinae: Anacaenini).
Mauricio García Ramírez y Alfredo Briceño…………......................
174
Tasa de fagocitosis en las especies de Acanthamoeba
provenientes de aguas subterráneas. Parte 2.
Silvana Pertuz, Miroslav Macek y Elisabeth Ramírez…………...……
201
Notas científicas.
. Contribución al conocimiento de la actividad pesqueria artesanal
del Cangrejo azul Callinectes sapidus (Brachyura:
Portunidae) en dos áreas geográficas del Municipio
Cabimas, Venezuela.
Helimar Vásquez y Edison Pascal………………………………..…….
222
Plantas utilizadas por la tribu Kariña en Pueblo Nuevo de
Caris, estado Anzoátegui, Venezuela.
Wilmer Díaz y Raúl Rivero………………………..……...…………...
238
Instrucciones a los autores……………….…..…………………………
247
Instructions for authors………………….………………………….…
257
Vol. 58, N0 2, Pp. 158-266, Julio-Diciembre 2024
UNA REVISTA INTERNACIONAL DE BIOLOGÍA PUBLICADA
POR
LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA, MARACAIBO, VENEZUELA
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 201
Tasa de fagocitosis en las especies de Acanthamoeba provenientes de
aguas subterráneas. Parte 2.
*Silvana Beatriz Pertuz Belloso1, Miroslav Macek2 y Elisabeth Ramírez Flores2
1Fundación Bchemokines Molecules and Therapies, Pachuca de Soto, Estado de
Hidalgo, México.
2Laboratorio de Microbiología Ambiental. Unidad Interdisciplinaria de
Investigación en Ciencias de la Salud y Educación de la Facultad de Estudios
Superiores de Iztacala. Universidad Nacional Autónoma de México, Estado de
México, México. ORCID ID: 0000-0002-0663-2987.
*Autor para correspondencia: Correo electrónico: silvanapertuz@autlook.com.
Página web. https://www.researchgate.net/profile/Silvana-Pertuz-2. Dir. Privada:
AV. Universidad 1900. Ed. 30. Int. 403. Col. Oxtopulco Universidad. Ciudad de
México. México. Cp. 04350.
RESUMEN
La fagocitosis es el mecanismo de toma de partículas sólidas por células
eucariotas jugando, por ende, un rol muy importante en la ecología. El objetivo de este
trabajo fue analizar la fagocitosis de las especies de Acanthamoeba aisladas de aguas
subterráneas del Valle del Mezquital (Hidalgo, México), y su impacto biológico. Para
esto fue elaborado un modelo matemático que permitió analizar la fagocitosis;
determinando las tasas de fagocitosis, formación de vacuolas, limpieza y de adherencia
de las especies de Acanthamoeba. La tasa de fagocitosis fue ≥ 50 a 250 bac ame-1 h-1en
ambas especies, al mismo tiempo que la formación de vacuolas fue ≥ 20 a 80 vac.
ame-1h-1. La tasa de limpieza de bacterias osciló de 100.000 bac-1 mm2 cels-1 h-1 en
Acanthamoeba griffini y hasta 1.200.000 bac-1 mm2 cels-1 h-1 en Acanthamoeba
castellanii. La tasa de adhesión fue ≥ 500.000 bac-ame-1 h-1 mm2 por superficie
membranal. El control del proceso de fagocitosis recayó sobre la tasa de adherencia
bacteriana a la superficie amebiana, que presentó una correlación positiva con la tasa
de fagocitosis. La fagocitosis, se concluye depende de las especies de Acanthamoeba, y
de los factores celulares como la formación de vacuolas y adherencia bacteriana a la
superficie amebiana. El impacto ecológico de Acanthamoeba quedó determinado por la
tasa de limpieza bacteriana por ameba. En este trabajo se demostró no solo importancia
DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.14574698
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
202
del mecanismo de fagocitosis, sino el rol que juegan las amebas de vida libre en la
regulación bacteriana en el ambiente.
Palabras clave: Amebas de vida libre, Acanthamoeba, bacterias, vacuolas,
membrana celular, adherencia, modelo matemático, impacto ecológico, vacuola.
Phagocytosis rate in Acanthamoeba species from groundwater. Part 2.
ABSTRACT
The phagocytosis is a mechanism of take of solid particles by eukaryotic cells,
playing a role in the ecology. The objective of this work was analyzed the phagocytosis
of Acanthamoeba species from groundwater of Mezquital Valley (Hidalgo State,
Mexico), and their biology impact. For this, a mathematics model was elaborate for
evaluated rates of phagocytosis, vacuole forming, clearing of bacteria, adherence and
digestion for Acanthamoeba species. The phagocytosis rate was ≥ 50 a 250 bac ame-1
h-1 both species; at the same time that the vacuole forming rate were ≥ 20 an 80 vac.
ame-1 h-1. The clearing rates were 100.000 bac-1 mm2 cells-1 h-1 for Acanthamoeba
griffini, until 1.200.000 bac-1 mm2 cells-1 h-1for Acanthamoeba castellanii. The
adherence rate was ≥ 500.000 bac-1ame-1 h-1 mm2 by membrane superface. The
phagocytosis process was regulated by the bacteria adherence rate on the amoebic
superface, in positive correlation with the digestion rates. In conclusion the
phagocytosis depended of Acanthamoeba species´s and cellular factors as vacuole
forming and bacterial adherence on the membrane superface of amoeba. The ecological
impact of Acanthamoeba is determined by the clearing rate of bacteria by amoeba. In
this work was demonstrated the importance of phagocytosis and the role of free living
amoebae in the regulation of bacteria in the environmental.
Key words Free-living-amoeba, Acanthamoeba, bacteria’s, cellular membrane,
adherence, mathematical model, ecological impact.
Recibido / Received: 11-11-2024 ~ Aceptado / Accepted: 30-11-2024.
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 203
INTRODUCCIÓN
La fagocitosis es un proceso antiguo y evolutivamente conservado, en el cual las
células eucariotas unen, engullen y destruyen las partículas, mismas que de acuerdo a
las definiciones clásicas pueden llegar a ser mayores de ≥ 250 nanómetros (nm) de
diámetro, y que tras un complejo proceso celular son relocalizadas desde la superficie
de la membrana plasmática a vesículas o vacuolas, y que luego de un mecanismo
celular y molecular terminan siendo digeridas (Tollis et al. 2010).
Este mecanismo fue estudiado por primera vez para Acanthamoeba por Weisman
y Korn (1967), los cuales definieron algunos de los parámetros que caracterizan la
fagocitosis en este grupo, entre ellos, que la tasa de fagocitosis es una función lineal
del tiempo y de la concentración de las células, del tamaño de las partículas (0.26-2.8
µm) y de la concentración de las mismas.
La toma de las bacterias induce la formación de copas durante la fagocitosis en las
que se capturan bacterias en bloques de unos 1.5 µm de radio y de unos 7 µm de
extensión de la membrana plasmática en Acanthamoeba, como fue demostrado por
Pertuz et al. (2021).
En términos generales, el papel de los protozoarios en la ecología y en la
regulación de las meta-poblaciones bacterianas, aún es tema de estudio, y su impacto
en la ecología global y en el biocontrol de las meta-poblaciones bacterianas ha sido
objeto de estudio por más de una década sin llegar a conocer totalmente estas
funciones.
Las amebas de vida libre, por su parte, juegan un papel biológico importante tanto
en los ciclos biogeoquímicos como en la depredación bacteriana y de otros protistas.
Las especies de Acanthamoeba tienen papel ecológico muy importante como
depredadores de bacterias de varios Phyla, principalmente: Cianobacteria (Bacterias
fotosintéticas, no-proteobacteria), Proteobacteria (Orden Enterobacteriales) y
bacterias Gram positivas (G+C baja, Orden Bacillales), No-Proteobacteria (del Orden
Bateroidales), Gram positivas (G+C alto, Ordenes Mycobacteriales y Actinomicetales),
que habitan microbiomas específicos (Wright et al.1981, Weekers et al. 1993, Rønn et
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
204
al. 2002, Prescott et al. 2002, Guillonneau et al. 2020, Amacker et al. 2022, Nasher y
Wren 2024).
En modelos de estudio más recientes, como las biopelículas se observar el efecto
de las de especies de Acanthamoeba sobre la composición y ecología de las mismas. El
efecto de A. castellanii provenientes de suelo sobre bacterias aisladas de biopelículas
formadas en sedimentos marinos, son un buen ejemplo de la fagocitosis de bacterias
marinas anaeróbicas-no proteobacteria (Orden Bateroidales), que componen estos
microbiomas (Guillonneau et al. 2020). Es en el modelo de Acanthamoeba que se ha
definido una de las funciones ecológicas mejor estudiadas que es el biocontrol de las
meta-poblaciones bacterianas por la ingesta vía deslizamiento o “pastoreo (Nasher y
Wren 2024, Rønn et al. 2002, Amacker et al. 2022).
Desde el punto de vista taxonómico, Acanthamoeba es un grupo de protistas
siempre en el tope de la investigación. Acanthamoeba tiene 12 subtipos o genotipos y
alrededor de 53 cepas. Existen varios “morfotipos”, y asociaciones filogenéticas,
complejos específicos de especies que incluyen a Acanthamoeba castellanii o
Acanthamoeba griffini (Kong 2009); muy probablemente pertenecientes a “ecotipos”
de acuerdo a Finlay (2004), que tienen un rol ecológico y existen por ese rol. Los
protistas amebozoa se clasifican filogenéticamente como Lobosea y Vanosea, que en
suelo llegan a tener más de 1. 399 ±77 metagenomas en este microbioma, y es en este
dónde ejercen su impacto principal (Singer et al. 2021, Jamy et al. 2022).
Los objetivos de este estudio fueron: 1. Caracterizar en un modelo matemático, la
fagocitosis de los aislados de Acanthamoeba de aguas subterráneas del Valle del
Mezquital (México). 2. Cuantificar la cantidad de bacterias ingeridas a través del
tiempo por especies de Acanthamoeba aisladas de aguas subterráneas del Valle del
Mezquital (México). 3. Analizar la superficie como mecanismo de captación de
bacterias por miembros de Acanthamoeba.
MATERIALES Y MÉTODOS
Especies.
Acanthamoeba culbertsoni clave ATCC 30171; Acanthamoeba castellanii, y
Acanthamoeba griffini aisladas de aguas subterráneas del Valle del Mezquital,
Klebsiella aerogenes Clave ATCC-13048 (Proteobacteria, Enterobacteria).
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 205
Aislamiento, identificación taxonómica y mantenimiento de las especies.
Cultivos de Klebsiella aerogenes -ATCC 13048 fueron repicados en agar
inclinado a caldo nutritivo de cultivo de acuerdo a los métodos estándar y luego
tratados para la tinción por fluorescencia según Pertuz et al. (2021).
Las especies de Acanthamoeba fueron aisladas y mantenidas en medios de cultivo
de PGY (0,00075 mM de Peptona; 0,00075 de Extracto de Levadura, 0,00 15 mM de
Glucosa, AD) a 30°C en todos los ensayos de fagocitosis de acuerdo a Pertuz et al
(2021).
Cuantificación de la fagocitosis en placas de cultivo.
Los trofozoítos de Acanthamoeba fueron incubados en placas de cultivo (Costar
de 12 pozos), conteniendo medio PGY (5ml por pozo) a 30°C y fueron observados por
microscopia de inversión, durante 2 días, hasta su fase exponencial de crecimiento
(Pertuz et al. 2021). Posteriormente, el medio PGY fue descartado y cada pozo fue
sometido a varios lavados con solución salina de Ringer; para ajustando a 1 x 106
amebas en 1 mL por pozo. Las bacterias marcadas con 1 mM fluorescencia DTAF (5-
DTAF (5-(4,6-Diclorotriazinil) Aminofluoresceína) fueron homogenizadas y ajustadas
a una concentración de 1 x 108 cel/m de acuerdo a Pertuz et al. 2021. Luego las
bacterias marcadas con DTAF (FLB) fueron dispensadas a una concentración estándar
de 1x 106 por pozo e incubadas a 30°C por 1 h. La fagocitosis fue detenida cada 5 min
con una solución Azida de Sodio fría (1,2 mM). Trascurridos los diferentes tiempos y
parada la fagocitosis, cada pozo fue raspado con una varilla de vidrio con goma y la
suspensión obtenida fue dispensada en el sistema de micro-filtración de 2 mm diámetro
ensamblado con una membrana de policarbonato de poro de 2µm de diámetro de color
negro. Luego cada muestra fue incubada con DAPI (Dihidrocloruro de 4',6-diamidino-
2-fenilindol), 2 mM durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las más de
36 muestras por ensayo fueron fijadas y montadas luego observadas para su análisis
por microscopía de fluorescencia de acuerdo a Pertuz et al. (2021).
Cálculos y modelo teórico
Condiciones experimentales. El contenido vacuolar se escaneó para cuantificar
las bacterias por vacuola y por número, usando microscopía de fluorescencia. En los
aislados ambientales de A. griffini-Valle Mezquital y A. castellanii-Valle Mezquital se
realizó el conteo de 50 trofozoítos por placa de cada condición. Estos experimentos se
206
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
hicieron siguiendo una cinética, y la fagocitosis se detuvo a los 5 min, 10 min, 30 min,
40 min y 60 min. En el caso de A. culbertsoni-ATCC 30171, se realizó el conteo de
hasta 100 trofozoítos por placa y condición, bajo las condiciones establecidas. Para los
conteos de las bacterias adheridas a la superficie amebiana se realizaron sobre A.
griffini-Valle Mezquital y A. culbertsoni -ATCC 30171, respectivamente. Para los
conteos solo del contenido vacuolar se realizaron experimentos con la técnica de
apagamiento bajo las condiciones señaladas, por triplicado y con las tres cepas
probadas de acuerdo Pertuz et al. (2021).
Construcción de la matriz de datos
Las bacterias cuantificadas en el interior de las vacuolas se designaron
arbitrariamente como nFLBx cels-1 (n Flurescence Label bacteria). Se calcularon los
parámetros que definen el impacto ecológico y la fisiología de las especies probadas de
Acanthamoeba, usando las fórmulas mostradas a continuación:
Tasa de formación de vacuolas es igual a nVac x cels-1 /h.
Donde:
Vac= número de vacuolas
Cels-1 = número de células
h=hora.
Tasa de fagocitosis de bacterias es igual a U (Uptake)= nFLB/t.
Donde:
nFLB =Número de bacterias
t=Tiempo en minutos
Y se calculó como: n[FLBDTAF]+ n[FLBDAPI] xn [FLBi] xhxmm2.
Impacto de las amebas sobre las metapoblaciones bacterianas o tasa de
limpieza bacteriana o clearing.
Y se calculó como:
Tasa de limpieza bacteriana= nFLB/[FLB] x t (h) x [Ameba] por mm2.
Y se calculó como: nFLB cels-h-1 por mm2.
Donde:
nFLB: Número de bacterias ingeridas
t= Tiempo
h= hora
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 207
Número de bacterias adheridas sobre la superficie amebiana se cuantificó y
designó como nFLBsup (FLB cells-1 superficie).
Tasa de adherencia bacteriana= nFLBadh x t.
Y se calculó como: n[FLBadh] x h.
Donde:
FLBadh= Numero de bacterias adheridas.
h= Hora
Índice de fagocitosis de las amebas que consumieron bacterias y que
formaron un número determinado de vacuolas.
Y se calculó como:
Índice de Fagocitosis= Nameba/ΣN =Nameba /100 x 100.
Análisis estadístico
Los valores promedios se obtuvieron por cada parámetro calculado como fue
descrito anteriormente y se compararon por tiempo, por triplicado y una p≤ 0.08 entre
especies. El análisis de correlación lineal se realizó entre la tasa de adherencia de
bacterias y de la fagocitosis de las mismas, usando herramientas de estadística-versión
5 para ANOVA del software de Origin Lab (Oringin Pro 2024).
RESULTADOS
Este sistema experimental de fagocitosis uso como presa una enterobacteria, K.
aerogenes de un diámetro esférico promedio de 1.5 µm, en stock bacteriano marcado
fluorescentemente (Fig. 1 a), y se usaron cepas de Acanthamoeba identificadas
taxonómicamente determinándose que los asilados del Valle del Mezquital fueron A.
castellanii y A. griffini, de acuerdo a las características fisiológicas y morfológicas,
principalmente el análisis morfológico de los quistes, como fue descrito en Pertuz et al.
(2021).
La fagocitosis en las especies estudiadas de Acanthamoeba presentó un patrón en
el que hubo una mayor fagocitosis en los primeros 5 min seguido de un aumento en el
número de vesículas y en tasa de limpieza bacteriana (Fig. 1d y Fig. 1 c). En las
especies estudiadas, la fagocitosis fue mayor desde los primeros 5 min, siendo el punto
importante del proceso a los 30 min en donde se observó un consumo máximo, y hasta
los 60 min, punto en el cual ya no había consumo de la presa (Fig. 1 b).
208
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
Figura 1. Tasas fisiológicas y ecológicas calculadas para los aislados de Acanthamoeba de
aguas subterráneas del Valle de Mezquital.
a. Diámetro promedio de la presa Klebsiella aerogenes en los ensayos de fagocitosis. Diámetro
determinado de acuerdo a materiales y métodos. Media (Y): 1,5 µm; y Error estándar: Er±0,09; N=9.
b. Tasas de fagocitosis. Ensayos realizados por triplicado y de acuerdo a materiales y métodos. Barra
negra: A. castellanii. Barra Blanca: A. griffini. Barra con entramado. A. culbertsoni. Barra con entrama
denso. Control sin fagocitosis. *, **p≤ 0,08.
c. Tasas de formación de vacuolas. Ensayos realizados por triplicado y de acuerdo a materiales y
métodos. Barra negra: A. castellanii. Barra Blanca: A. griffini. Barra con entramado. A. culbertsoni. [*,**
Diferencias significativas (p≤0,08)]. Barra con entramado denso. Control sin fagocitosis.
d. Tasas de limpieza e impacto sobre las bacterias. Ensayos realizados por triplicado y de acuerdo a
materiales y métodos.[F= 4.08; p≤0.07*, ** diferencias significativas]. Barra negra: A. castellanii. Barra
Blanca: A. griffini. Barra con entramado. A. culbertsoni
e. Claves: A. castellan: Acanthamoeba castellanii. A. culbertso: Acanthamoeba culbertsoni. A.
griffini: Acanthamoeba griffini. Control: Sin fagocitosis.
f. Claves gráficos: Bac: Bacterias. H: Horas. Vac: Vacuolas.
-10 0 10 20 30 40 50 60 70
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Vac amebas-1 h-1
Tiempo (min)
Acastellani
A.griffini
A.culbertso
Control
-10 0 10 20 30 40 50 60 70
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Bac-1 mm2 amebas-1 h-1
Tiempo (min)
A.castellan
A.griffini
A.culbertso
010 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Porcentaje (%)
Diáme-
tro
esféri-
co
equiva-
lente
(µm)
a
b
c
d
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 209
La tasa de fagocitosis de A. griffini-Valle Mezquital fue de 14 bacamebas-1 h-1 por
mm2 a los 30 min, en promedio (Fig. 1b). Esta tasa osciló de 2 bacamebas-1 h-1 por
mm2 desde los primeros 10 min hasta 14 bacame-1 h-1 por mm2 a los 30 min,
decreciendo a 0 bac amebas-1 h-1 por mm2 a los 60 min, estas diferencias fueron
estadísticamente significativas a p≤0.08 (F= 3,329; p = 0,06599) (Fig. 1 b). A.
castellanii-Valle Mezquital, por otro lado, presentó un patrón de fagocitosis semejante
a A. griffini-Valle Mezquital, siendo la cantidad de bacterias fluorescentes capturadas
mucho mayor. A los 10 min. A. castellanii-Valle Mezquital consumió más de 50
bacamebas-1 h-1 por mm2, incrementando 250 bac amebas-1 h-1 por mm2 a los 30 min y
decreciendo a menos de 50 bacamebas-1 h-1 por mm2 a los 60 min, estas diferencias no
fueron estadísticamente significativas (Fig. 1 c) (n= 5; F= 1.49; p= 0.27). A. culbetsoni-
ATCC 30171 siguiendo el mismo patrón, presentó una alta tasa de fagocitosis a los 5 a
10 min de 35.25 bac mm2 h-1 y se redujo a 28.07 bac mm2h-1 a los 30 min
disminuyendo hasta 12.93 bac mm2 h-1, estas diferencias tampoco fueron
estadísticamente significativas (F=0.52; p= 0.6).
En la Figura 1 c se observa la tasa de formación de vesículas osciló entre 0 a los 5
min hasta más de 25 vesículas por hora. A. griffini-Valle Mezquital presentó una tasa
de formación de vacuolas que oscilaron de 0 vacameba-1 h-1 a los 5 min hasta más de 10
a 25 vacameba-1 h-1por hora. A. castellanii-Valle Mezquital, en cambio, presentó una
rápida formación de vesículas desde los primeros 5 min alcanzando hasta 80 vac
ameba-1 h-1, tiempo después del cual este parámetro decreció a 20 vac. ameba-1 h-1,
estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (F=1.28; p=0.23). A
culbertsoni-ATCC30171, presentó una tasa de formación de vacuolas de 5 vacameba-1
h-1 en promedio. Hay que destacar que la tasa de formación de vacuolas se redujo casi
hasta cero vac ameba-1 h-1 del proceso de fagocitosis, estas diferencias fueron
estadísticamente significativas a p≤ 0.08 (F= 4.46; p= 0,06).
El rol ecológico de las cepas de Acanthamoeba se observa en la figura 1 d,
mostrando que A. griffini-Valle Mezquital presentó un consumo constante de bacterias
durante el tiempo de incubación en los ensayos de fagocitosis; oscilando de 100.000 a
200.000 bac-1 mm2 cels-1 h-1 desde los primeros 5 min hasta más de 100.000 a 300.000
bac-1 mm2 cels-1 h-1 a la hora. A. castellanii-Valle Mezquital, en cambio, presentó una
mayor tasa de limpieza bacteriana que osciló de 800.000 a 1.200.000 bac-1 mm2 cels-1
h-1 en los primeros 5 min, disminuyendo a cero bac-1 mm2 cels-1 h-1 a partir de los 10
210
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
min. Estas diferencias interespecíficas de las tasas de limpieza bacteriana fueron
estadísticamente significativas a p≤ 0.08 (F= 4.08; p=0.07). A. culbetsoni-ATCC30171,
consumió hasta de 600.000 bacterias por mm2 desde los primeros 10 min decreciendo a
los 30 min hasta la mitad del consumo inicial (Fig. 1 d). A. culbertsoni-ATCC30171, a
diferencia de las cepas ambientales, presentó una actividad fagocítica inferior.
Entre los factores que definen la fagocitosis de Acanthamoeba se encontró una
relación entre la adherencia bacteriana a la superficie amebiana y la ingestión de las
bacterias. Hubo una relación inversa entre la tasa de adhesión de las bacterias a la
superficie amebiana y la tasa de fagocitosis (Fig. 2), esta relación se puede ver a los 20
minutos de incubación de la presa con las amebas. Es así, como se puede observar que
existe una alta tasa de fagocitosis y una reducción de la adhesión bacteriana. Desde los
primeros 5 min, se presentaron más de 500.000 cels cels-1 h-1 de superficie pudiendo
ser de hasta de un millón de cels cels-1 h-1 por mm2. El conteo de bacterias en la
superficie amebiana disminuye a partir de los 10 min y así se mantuvo hasta los 60 min
con una cantidad de bacterias en superficie menor a 500.000 cels cels-1 h-1 (Fig. 2). La
tasa de fagocitosis oscilo entre 70 cels cel-1 h-1 a los 5 min disminuyendo a 30 cels cel-1
h-1 a partir de los 10 min y hasta los 60 min (Fig.2); estas diferencias fueron
estadísticamente significativas (F= 49.56419; p≤ 0.001).
Figura 2. Adherencia bacteriana a la superficie amebiana en Acanthamoeba griffini
aislada del Valle del Mezquital.
010 20 30 40 50
-200000
-100000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Tasadeadhe
Tasadigest
Tiempo (min)
Cels cels-1 h-1 mm2
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Cels cels-1 h-1
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 211
Cada uno de los parámetros fue calculado como se especificó en materiales y
métodos. F= 10.09; p≤ 0.001, altamente significativo p≤ 0,08, para la tasa de
adherencia bacteriana a la superficie amebiana. F= 63.80893, p≤ 0.001, altamente
significativo p≤ 0.08, para la tasa de fagocitosis.
El número de las bacterias adheridas a la superficie amebiana fue desde 500.000
bac-1 superficie amebiana h-1, en algunos de los especímenes, hasta más de 1.500.000
bac-1 superficie amebiana h-1, en otro de los especímenes, a los 5 min, tiempo en el cual
la tasa de fagocitosis fue de cero, así como la tasa de formación de vacuolas y de
limpieza bacteriana, respectivamente (Fig. 3 a).
El mecanismo para atrapar bacterias por parte de las amebas de vida libre fue la
adhesión bacteriana, que fue mucho mayor que la tasa de fagocitosis (Fig. 3 b). Las
bacterias adheridas fueron de 500.000 cels cels-1 h-1 a la superficie amebiana en los
primeros 30 min por espécimen, existiendo especímenes con más de 1.2.000.000 cels
cels-1 h-1 en superficie amebiana y otros especímenes con menos de 400.000 cels cels-1
h-1. En cambio, la tasa de fagocitosis por espécimen fue una magnitud constante, en la
cual, las amebas consumieron menos de 100.000 cels h-1 por espécimen, y la tasa de
limpieza bacteriana fue de 24.490 cels cels-1 h-1 para la cepa de A. griffini-Valle
Mezquital, siendo este un patrón también observado en A. culbertsoni. Las diferencias
estadísticas entre la adherencia y la fagocitosis fueron altamente significativas,
denotando un proceso regulado a nivel celular (F= 10.09; p= 1.22345E-4; n= 50). De la
misma manera, la tasa de adherencia bacteriana a la superficie amebiana presentó
diferencias altamente significativas (F= 49.56419; p= 8.27194E-10). Los análisis de
correlación lineal mostraron que hay una relación directa entre la tasa de adherencia
bacteriana y la tasa de fagocitosis bacteriana por las amebas (F= 25.88; p= <0.0001,
tomando en cuenta que Prob>F). La fagocitosis fue alta desde los primeros 5 min, en
donde se observa que la adherencia bacteriana es menor. En algunos de los
especímenes la tasa de fagocitosis de las bacterias fue constante de 6000 cels cels-1 h-1,
mientras que la adherencia bacteriana fue de 8000 cels cels-1 mm2 h-1. En otros
especímenes se puede observar que cuando la tasa de fagocitosis baja, la tasa de
adherencia fue alta. Hay especímenes en donde la tasa de fagocitosis baja a 1000 cels
cel-1 h-1, mientras que la adherencia fue alta en varios de los especímenes. Hay que
destacar que el tiempo de incubación fue de 30 min mostrando un contraste con los
especímenes con incubación inicial, en donde la tasa de adherencia es alta y no ha
ocurrido la fagocitosis (Fig. 3 b).
212
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
Figura 3. Adhesión bacteriana a la superficie amebiana por espécimen.
a. Proporción de bacterias adheridas por espécimen. Inferior. Tabla con parámetros calculados. n=3.
F= 10.09; p≤ 0.0001. Parámetros. t=0; tasa de fagocitosis (Cels cels-1 h-1) =0; tasa de formación de
vacuolas (Vac cels-1 h-1) =0; Tasa de limpieza bacteriana (Cels cels-1 mm-2) =0.
b. Relación entre las bacterias adheridas por superficie amebiana y la tasa de eliminación bacteriana.
Proporción de bacterias adheridas por espécimen. Inferior. Tabla con parámetros calculados en
promedio. Análisis de correlación lineal: F= 25, 88; p= <0.0001, tomando en cuenta que Prob>F.
Parámetros. t=30; tasa de fagocitosis (Cels cels-1 h-1) = 300; tasa de formación de vacuolas (Vac
cels-1 h-1) =20; Tasa de limpieza bacteriana (Cels cels-1 mm-2) = 24490.
0 5 10 15 20 25 30 35 40
-200000
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
Cels adheridas a la superficie bacteriana h-1
Especímenes
a
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
Especímenes
Cels cels-1 mm2 h-1
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Cels adh cels-1 h-1
b
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Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 213
DISCUSIÓN
La primera parte de este trabajo mostró que las amebas de vida libre del género
Acanthamoeba forman copas fagocíticas, en las cuales se toman flóculos o bloques de
bacterias, a este evento le siguen la formación de las vacuolas, que incorporan las
bacterias; y que como se corroboró en este modelaje, estas vacuolas conteniendo
bacterias entran en proceso de digestión y este contenido desaparece por completo,
llegando a presentarse cero en tasas de formación de vacuolas.
En esta segunda parte de este trabajo demostró que la fagocitosis de los aislados
ambientales de Acanthamoeba capturan y fagocitan bacterias desde los primeros 5
min; tiempo en el cual se alcanzó la mayor tasa de fagocitosis, indicando la capacidad
y el control vacuolar de los compartimientos intracelulares en este género. De las cepas
de Acanthamoeba, A. castellanii-Valle Mezquital presentó la de mayor actividad
fagocítica con respecto a las otras cepas, siendo este proceso muy rápido y tan solo en
10 minutos las vacuolas entran en digestión del contenido.
El control de la fagocitosis por el sistema vacuolar ha sido descrito previamente
por Bowers et al. (1981). Los compartimientos vacuolares tienen que digerir o expulsar
el material no digerible después de trascurrido el tiempo de “digestión”.
El tiempo en el que transcurre la fagocitosis fue estudiado también por Oates y
Touster (1976), los cuales encontraron enzimas de fagolisomas implicadas en la
digestión del material ingerido. Stewart y Weisman (1972), encontraron que después
de 2 horas ocurre un proceso de exocitosis o expulsión del material no ingerible,
explicando así el declive de la fagocitosis.
Resultados similares a los mostrados en este trabajo en cuanto a la cinética de la
fagocitosis fueron presentados por Avery et al (1995). Estos investigadores
encontraron, que ya a los 5 min había una alta fagocitosis de perlas de látex, usadas
como presa; con la limitante que las presas fueron artificiales. Avery et al. (1995), en
A. castellanii observaron que los trofozoítos empiezan a expulsar las perlas de látex
desde los 20 min. El número de perlas de látex no es comparable con el número de
bacterias que puedan ingerir las amebas de vida libre durante la fagocitosis, usando
presas digeribles. No obstante, la tendencia encontrada en este trabajo es similar al pa-
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
214
trón de fagocitosis encontrado en los aislados de Acanthamoeba del Valle del
Mezquital. Shaheen y Ashbolt (2021), encuentran también que la fagocitosis es un
evento que ocurre muy rápidamente, ya desde los primeros 5 min de interacción entre
las especies de Acanthamoeba y la presa comienza la internalización y los procesos de
digestión del material ingerido, con sus excepciones; corroborando las observaciones
de este trabajo.
En este trabajo se encontró que la fagocitosis depende de la tasa de formación de
vacuolas, como fue mostrado en los resultados para las diferentes presas probadas en
este estudio. A. castellanii en el proceso de fagocitosis presentó más de 40 vacuolas
conteniendo bacterias fluorescentes por amebas por hora, la máxima tasa de formación
de vacuolas que se encontró para estas especies, tomado en cuenta que el diámetro de
la presa fue de 1.4 µm en promedio del cultivo de Klebsiella aerogenes. Las otras
especies de Acanthamoeba no fueron tan competitivas, y sus tasas de formación de
vacuolas estuvieron por debajo de 10 vacuolas por amebas por hora. De esta misma
manera, la cantidad de bacterias fluorescentes consumidas por A. castellanii-Valle
Mezquital fue de hasta 1.2 millones por ameba por hora. Hay que destacar que tanto
las tasas de fagocitosis como de formación de vacuolas no habían sido estudiadas para
este género de amebas de vida libre, constituyendo un aporte de este trabajo a la
biología de las amebas de vida libre.
Similarmente, Korn y Weisman (1967), encontraron vesículas fagocíticas, usando
microscopia electrónica, que pueden contener perlas de látex de entre 0.68 a 2.68 µm
bajo condiciones saturas de perlas de látex y de amebas de libre en el orden de 1
millón, parecido a las condiciones usadas en los ensayos de este trabajo.
Las tasas de limpieza de las diferentes cepas de Acanthamoeba del Valle del
Mezquital presentaron diferencias significativas, con lo cual se corrobora que la
fagocitosis tiene un impacto sobre las metapoblaciones bacterianas en el ambiente y
que este depende de las especies de la Acanthamoeba que se trate, y como vimos
anteriormente depende totalmente de la formación de las vacuolas. En este parámetro
en particular, la tasa de limpieza alcanzó hasta 300 mil bacterias por mm2 por ameba
por hora en A. griffini hasta 1.2 millones de bacterias por mm2 por ameba por hora en
A. castellanii. Las tasas de limpieza de la cepa de referencia no fueron diferentes a lo
observado con los aislados ambientales, siendo entonces una de las características
intraespecificas y fisiológicas de las especies de Acanthamoeba.
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 215
Weekers et al (1993), realizando estudios sobre la producción de nitrógeno a
partir de la biomasa bacteriana, encontraron el aumento de amonio y el crecimiento
amebiano, corroborando en parte la idea de que las amebas de vida libre “consumen”
bacterias para establecer el crecimiento y la liberación de nitrógeno, que contribuye
importantemente en la ecología de los ensamblajes microbianos.
Similarmente a los resultados de este trabajo, Weekers et al. (1993) establecieron
que hay especies de amebas de vida libre fueron más exitosas; tal es el caso de
Hartmanne llavermiformis que presentó una alta tasa de crecimiento, con la presa de
Enterobacterias, E. coli K-12, y K. aerogenes. Otras amebas de vida libre, como la
misma A. castellanii y A. polyphaga presentaron comportamientos semejantes a H.
vermiformis. La producción de amonio fue también mayor con enterobacterias, como
se presentó, también, en este trabajo con el modelo de A. castellanii y A. graffini del
Valle del Mezquital y la presa de K. aerogenes, una enterobacteria. La preferencia por
algunas de las especies bacterianas que encontramos aquí en este trabajo también fue
determinada por Weekers et al. (1993), siendo las enterobacterias las más consumidas.
Otras especies probadas por Weekers et al. (1993), habitantes comunes de los
ensamblajes microbianos en suelo, Agrobacterium tumefaciens, Arthrobacter simplex,
y Pseudomonas fluorescens son presas que también soportan el crecimiento amebiano
y la producción de amonio. Otras potenciales presas fueron medidas también para
fagocitosis, tal es caso de Bacillus cereus, Escherich iacoli (E. coli), Salmonella
typhimurium, Staphylococcus aureus (S. aureus), y Listeria monocytogenes (L.
monocytogenes), todas cepas patogénicas para el hombre, todas las cuales fueron
ingeridas, excepto S. aureus, que, aunque fue fagocitada no fue ingerida, indicando que
hay un tipo de presa que es favorable para las especies de Acanthamoeba.
Un ejemplo del impacto ecológico que tiene A. castellaniies el de biopelículas
formadas en lentes de contacto y que está basado en la interacción con Xanthomonas
maltophila (X. maltophila), Pseudomonas paucimobilis, Flavobacterium breve,
Staphylococcus epidermidis, Staphyloccus aureus y Escherichia coli, en las cuales se
encontró una alta tasa de crecimiento de las amebas de vida en estos ambientes
(Bottone et al. 1992).
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
216
La interacción de las amebas de vida libre del género Acanthamoeba con
microorganismos de ensamblajes microbianos diversos fue también analizada por
Wright et al. (1981), usando un método clásico, en el cual, los trofozoítos de A.
castellanii fueron incubados en placas de agar inoculados con cianobacterias (Bacterias
Gram negativas fotosintéticas, no proteobacterias); encontrando que los trofozoítos de
A. castellanii fagocitaban cianobacterias de las especies Gleocapsa alpicola, Anacystis
nidulans, Anabaena flas-aquae, y Anabaena cylindrica, al formar placas en la
superficie del agar, indicando con ello que son también importantes reguladores de
bacterias, tanto en ambientes acuáticos como en el suelo.
Es evidente que las especies de Acanthamoeba presentan una gran preferencia por
las enterobacterias. Los resultados de este trabajo muestran que las especies del género
de Acanthamoeba probadas en este estudio fagocitaron todas una enterobacteria, K.
aerogenes. Similarmente, Shaheen y Ashbolt (2021), encontraron que A. Polyphaga y
H. vermiformis “consumen” con preferencia a E. coli sobre Legionella pneumophila,
que sin embargo es fagocitada, pero no digerida.
Hallazgos muy importantes de este trabajo fueron sobre la adherencia de las
bacterias a la superficie amebiana y la digestión como reguladores de la fagocitosis
amebiana y su impacto en la tasa de limpieza bacteriana.
La importancia de la superficie amebiana fue analizada por Rogerson et al.
(1996). Estos investigadores, usando también el marcaje de la presa con fluorocromos
y amebas aisladas de sedimentos marinos de diferentes morfotipos, lograron calcular el
volumen de las amebas marinas, estableciendo que las amebas más pequeñas tenían
más de 50 µm3 y consumen 10 bac-1 h-1 por ameba, a medida que aumentaba el
volumen de las amebas hasta 61. 021 µm3, aumentaba el consumo de las bacterias
hasta 1. 400 bac-1 h-1 por ameba.
La extensión de la membrana también fue observada por Bowers et al. (1981),
mediante microscopia electrónica. Estos autores encontraron que el volumen celular
aumenta 5% y la membrana plasmática se extiende, durante los primeros 5 min de
fagocitosis, siendo el diámetro de la membrana de menos de 0.5 µm3. El diámetro de
las vacuolas fue de 3 µm, y el sistema vacuolar formado, en A. castellanii, fue de 15-
20 vacuolas por ameba, encontrando hasta 40 cels-1 por ameba. A. castellanii presentó
también una relación proporcionar entre la extensión de la superficie de la membrana
plasmática de 1 unidad logarítmica hasta 1.8 unidad logarítmica y el volumen total va-
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 58. Nº 2, Julio-Diciembre 2024, Pp. 201-221 217
cuolar aumenta de 0.2 unidad logarítmica a 0.8 unidad logarítmica, un proceso que
tiene que ver directamente con la fagocitosis, al ocurrir el vaciado de las vacuolas
disminuye la superficie de la membrana plasmática.
Los resultados de este trabajo establecen el hecho de que al aumentar superficie
de la membrana plasmática amebiana se incrementa la posibilidad de la captura de más
bacterias. En el caso de Burkholderia pseudomallei (ẞ-proteobacteria) fue observado a
nivel de microscopia electrónica una modificación de parches de la membrana
plasmática en forma de una proyección que permite que las bacterias queden atrapadas
en la membrana plasmática, provocando la fagocitosis de las bacterias en una vacuola
por A. astronyxis, corroborando los resultados de este trabajo (Inglis et al. 2000).
La capacidad de fagocitosis y el impacto de las especies de Acanthamoeba en el
ambiente es alta. Inglis et al. (2000) encontraron 3.6 x 106 bacterias en el medio de
recuperación, luego del proceso de sonicación del cultivo amebiano, evidenciando la
importancia que tienen las amebas de vida libre del genero Acanthamoeba en el
biocontrol de las bacterias en el ambiente.
De acuerdo al tipo de bacteria se inducen los cambios en la superficie de la
membrana amebiana. Así, en la interacción de L. pneumophila con A. castellanii se
forma un seudópodo superenrollado que permite la fagocitosis de esta bacteria (Bozue
y Johnson 1996).
Las especies de Acanthamoeba no solo despliegan la estrategia de aumentar su
superficie celular, sino que también se ha observado en biopelículas formadas en lentes
de contacto a partir de bacterias Xanthomanas, Pseudomonas y E. coli, la formación de
una matriz en la superficie amebiana, que contribuye a aumentar la posibilidad de que
se atrapen más bacterias (Bottone et al. 1994).
La importancia que tiene la superficie amebiana en la biología de las amebas de
vida libre, fue observada por Bottone et al. (1994) a nivel de microscopía electrónica
que X. maltophila, interaccionaron con “pockets” en los cuales se adhieren estas
bacterias a la superficie amebiana en el caso de A. polyphaga, en lo que se reconoce
como el glicocalix de la superficie amebiana. Los resultados obtenidos en este trabajo,
en los cuales se observó que la superficie amebiana es una plataforma de interacción
con las bacterias, y que es la estructura celular que mayor importancia tiene en la fago-
Fagocitosis en especies de Acanthamoeba.
Pertuz et al.
218
citosis de bacterias y el papel que juegan en la ecología de las amebas de vida libre.
CONCLUSIONES
En este trabajo se encontró que la fagocitosis es regulada por procesos celulares,
siendo la superficie de Acanthamoeba un mecanismo de captura de bacterias, que
depende también de procesos celulares. Por último, se encontró que el impacto de
Acanthamoeba es importante en la depredación de las bacterias y por supuesto juegan
un papel importante en la regulación de las meta-poblaciones bacterianas en el
ambiente, especialmente suelo, en donde presentan la mayor abundancia y
biodiversidad.
AGRADECIMIENTOS
A Rosario Sánchez de Vázquez por su asesoría técnica en el análisis por
microscopia de fluorescencia de las muestras y el estudio de la adhesión bacteriana.
Al Comité Editorial de esta revista quienes revisaron este trabajo, y gracias a los
cuales se construyó una mejor versión del mismo.
LITERATURA CITADA
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BOLETIN
DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
AN INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGY
PUBLISHED BY THE UNIVERSITY OF ZULIA, MARACAIBO, VENEZUELA
Vol. 58, N° 2, Pp. 158-266, July-December 2024
Leaf Dimensions and photosynthesis of Rhizophora mangle in
estuarine areas under contrasting hydrological conditions.
Flora Barboza y Ernesto Medina..………………………………….
158
Inéditas especies de escarabajos acuáticos del género Anacaena en
el Alto Apure, Venezuela (Hydrophilidae: Chaetarthriinae:
Anacaenini).
Mauricio García Ramírez y Alfredo Briceño……..……………............
174
Phagocytocis rate in species Acanthamoeba from groundwater.
Part 2.
Silvana Pertuz, Miroslav Macek y Elisabeth Ramírez………...........................
201
Scientific Notes.
Contribution to the knowledge of the artisan fishing activity of
the Blue crab Callinectes sapidus (Brachyura: Portunidae)
in two geographical areas of the Cabimas Municipality,
Venezuela.
Helimar Vásquez y Edison Pascal……………………….……………...
222
Plants used by the Kariña tribe in Pueblo Nuevo the Caris,
Anzoátegui, Venezuela.
Wilmer Díaz y Raúl Rivero………………………..…………..……….
238
Instrucciones a los autores……………….…..…………………………
247
Instructions for authors……………….…..………………………...……
257