993
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v38.n4.14 ISSN 2477-9407
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido: 26-09-2020 . Aceptado: 23-03-2021.
*Autor de correspondencia. Correo electrónico: jorgeluis.rubio@gmail.com
Efecto del estrés anisosmótico sobre la integridad
estructural y funcional de la membrana plasmática
y acrosomal de espermatozoides ovinos
Effect of anisosmotic stress on the structural and
functional integrity of the plasma and acrosomal
membrane of ram sperm
Efeito da tensão anisosmótica na integridade estrutural
e funcional do plasma e da membrana acrossómica dos
espermatozóides de ovinos
Jorge Rubio-Guillén
1
*, Carla Osorio-Meléndez
1
, Decio
González-Villalobos
1
, Héctor Nava-Trujillo
2
y Armando
Quintero-Moreno
1
1
Laboratorio de Andrología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia
(LUZ). Apdo. 15252. 4005-A. Maracaibo, Venezuela. Correo electrónico: (JR) jorgeluis.
rubio@gmail.com, ; (CO) carlaosorio85@gmail.com, ; (DG) decio.gonzalez@gmail.com,
; (AQ) armando.quintero@fcv.luz.edu.ve, .
2
Instituto de Investigaciones Agropecuarias,
Universidad de los Andes. Mérida-Venezuela. hectornava00@gmail.com, .
Resumen
La integridad de la membrana plasmática (MP) y del acrosoma (MA) han
sido dos de los parámetros de valoración seminal más estudiados por su rol
preponderante como límite celular y por ser responsable de hacer efectivas las
interacciones entre células. Con miras a valorar más objetivamente los efectos del
estrés osmótico sobre la integridad de la MP y MA, así como la relación de cambio
ocurrido durante la criopreservación seminal, se evaluaron cinco eyaculados
recién colectados, refrigerados a 5 ºC y descongeladas por morueco/sesión durante
5 semanas consecutivas. Mediante la tinción eosina-nigrosina (EN) se evaluó
la vitalidad (VIT), las morfo anomalías y la respuesta celular luego de realizar
las pruebas de resistencia osmótica (ORT), y de endósmosis (HOST). El efecto
directo de la anisosmosis y la criopreservación sobre las variables dependientes
fueron analizados mediante el procedimiento GLM (SAS
®
) y cuando se observaron
994
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
diferencias, se cuanticaron los efectos mediante el LSMEANS. Todos los valores
de calidad espermática estudiados fueron afectados signicativamente (P<0,001)
por la criopreservación (VIT, ORT, HOST). El ORT demostró como el acrosoma
fue una de las estructuras más afectadas por la criopreservación (P<0,001). En
conclusión, el presente estudio conrma que el estrés anisosmótico afecta la célula
espermática de manera importante, comprometiendo los valores referenciales que
cuantican la calidad seminal, sobretodo la MA y MP.
Palabras clave: estrés osmótico, semen, calidad espermática, ovinos.
Abstract
The integrity of the plasma membrane (MP) and the acrosome (MA) have
been two of the most studied seminal evaluation parameters due to their role
as a cell boundary and because they are responsible for interactions between
cells effective. To assessing more objectively the effects of osmotic stress on the
integrity of the PM and MA, as well as the rate of change that occurred during
seminal cryopreservation, ve freshly collected ejaculates were evaluated,
refrigerated at 5 ºC and thawed per ram/session during 5 consecutive weeks.
Using eosin-nigrosin (EN) staining, vitality (VIT), morpho abnormalities and
cellular response were evaluated after performing osmotic resistance (ORT) and
endosmosis (HOST) tests. The direct effect of anysosmosis and cryopreservation
on the dependent variables were analyzed using the GLM procedure (SAS
®
) and
when differences were observed, the effects were quantied using the LSMEANS.
All the sperm quality values studied were signicantly affected (P <0.001) by
cryopreservation (VIT, ORT, HOST). The ORT demonstrated how the acrosome
was one of the structures most affected by cryopreservation (P <0.001). In
conclusion, the present study conrms that anysosmotic stress affects the sperm
cell in an important way, compromising the reference values that quantify semen
quality, especially MA and MP.
Key words: osmotic stress, semen, sperm quality, ram.
Resumo
A integridade da membrana plasmática (PM) e do acrossoma (AM) foram
dois dos parâmetros mais estudados de avaliação seminal devido ao seu
papel predominante como limites celulares e porque são responsáveis por
interacções celulares ecazes. A m de avaliar mais objectivamente os efeitos
do stress osmótico na integridade PM e AM, bem como a taxa de mudança que
ocorre durante a criopreservação seminal, foram avaliados cinco ejaculados
recentemente recolhidos, refrigerados a 5 °C e descongelados por morueco/sessão
durante 5 semanas consecutivas. A coloração Eosin-nigrosina (EN) foi utilizada
para avaliar a vitalidade (VIT), morfo-normalidades e resposta celular após
teste de resistência osmótica (ORT) e teste de endosmose osmótica (HOST). O
995
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
efeito directo da anisosmose e criopreservação sobre as variáveis dependentes
foi analisado utilizando o procedimento GLM (SAS
®
) e quando foram observadas
diferenças, os efeitos foram quanticados utilizando LSMEANS. Todos os valores
de qualidade de esperma estudados foram signicativamente (P<0,001) afectados
pela criopreservação (VIT, ORT, HOST). O ORT mostrou como o acrossoma era
uma das estruturas mais afectadas pela criopreservação (P<0,001). Em conclusão,
o presente estudo conrma que o stress anisosmótico afecta signicativamente a
célula espermática, comprometendo os valores de referência que quanticam a
qualidade do esperma, especialmente a MA e a MP.
Palavras-chave: stress osmótico, sémen, qualidade do esperma, ovelhas.
Introducción
Los ovinos en Venezuela tienen un
gran potencial socioeconómico, ya que
se podrían establecer exitosamente en
ecosistemas poco útiles para la crianza
de bovinos, obteniendo buenos índices
en producción de carne (Villasmil
et al., 2011). Sin embargo, a pesar
de las ventajas comparativas y la
diversidad de ambientes a los cuales
ellos se adaptan, la disponibilidad
de información de programas de
mejoramiento reproductivo en estas
especies es escasa (Yániz et al., 2015). En
zonas tropicales su cría se ha destinado
a pequeños productores, en condiciones
extensivas, en donde el uso de la
tecnología actual es casi inexistente,
reportándose solamente en el ámbito
cientíco nacional algunos hallazgos
sobre calidad seminal de reproductores
utilizados para inseminación articial
(IA) (Rubio-Guillén et al., 2012 y 2014a).
En la industria ovina y en especial
en Latinoamérica el uso de la IA con
semen criopreservado es prácticamente
inexistente, motivado al hecho de que
la IA con semen descongelado reporta
resultados desfavorables debido a la
imposibilidad del operador de depositar
el semen al nal del cervix o de manera
Introduction
Sheep in Venezuela have great
socioeconomic potential, since they
could be successfully established in
ecosystems that are not very useful for
raising cattle, obtaining good rates of
meat production (Villasmil et al., 2011).
However, despite the comparative
advantages and the diversity of
environments to which they adapt,
the availability of information on
reproductive improvement programs
in these species is scarce (Yániz et al.,
2015). In tropical areas, their breeding
has been destined to small producers,
in extensive conditions, where the
use of current technology is almost
non-existent, with only some ndings
on the semen quality of rams used
for articial insemination (AI) being
reported in the national scientic eld
(Rubio-Guillén et al., 2012 and 2014a).
In the sheep industry and especially
in Latin America, the use of AI with
cryopreserved semen is practically non-
existent, due to the fact that AI with
thawed semen reports unfavorable
results due to the inability of the
operator to deposit the semen at the
end of the cervix or intrauterine way,
a fact that favors suboptimal results.
996
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
intrauterina, hecho que propicia
resultados sub-óptimo. Otra variante
importante corresponde a la viabilidad
espermática post descongelado que, en
ovinos es inferior a la obtenida en toros
(Rubio-Guillén, 2017), probablemente
debido a que no se ha establecido una
presión de selección genética en base
a ejemplares buenos congeladores,
no obstante, esta situación conduce
a buscar nuevas alternativas que
evalúen la calidad seminal de muestras
destinadas a IA. Las pruebas que
miden el estrés osmótico son una
alternativa viable, ya que, podrían ser
usadas para predecir la congelabilidad
(Quintero-Moreno et al., 2005 y 2011;
Rubio-Guillén et al., 2014a; Peris-Frau
et al., 2020) debido a que el proceso de
congelación altera de manera sustancial
la osmolaridad del semen.
Basado en la tolerancia osmótica,
actualmente existen un gran
número de pruebas que someten las
muestras seminales a condiciones
de baja osmolaridad (Nava-Trujillo
et al., 2012; Rubio-Guillén et al.,
2014a; Peris-Frau et al., 2020)
o alta osmolaridad (Quintero-
Moreno et al., 2005) para evaluar
la integridad funcional de la MP y/o
MA durante todo el proceso y así
establecer si hay un alto porcentaje
de espermatozoides viables pos
descongelación (González-Villalobos,
2017; Peris-Frau et al., 2020). En
base a los hechos explicados se
pretende analizar si existe una
relación estrecha entre la osmo-
adaptación de espermatozoides
recién colectados, refrigerados,
descongelados y la calidad seminal
de reproductores ovinos tropicales.
Another important variant corresponds
to post-thaw sperm viability, which in
sheep is lower than that obtained in
bulls (Rubio-Guillén, 2017), probably
due to the fact that a genetic selection
pressure has not been established based
on good freezer specimens, no However,
this situation leads to the search for new
alternatives that evaluate the seminal
quality of samples destined for AI. Tests
that measure osmotic stress are a viable
alternative, since they could be used to
predict freezability (Quintero-Moreno et
al., 2005 and 2011; Rubio-Guillén et al.,
2014a; Peris-Frau et al., 2020) because
the freezing process substantially alters
the osmolarity of the semen.
Based on osmotic tolerance, there
are currently a large number of
tests that subject seminal samples
to low osmolarity conditions (Nava-
Trujillo et al., 2012; Rubio-Guillén et
al., 2014a; Peris-Frau et al., 2020) or
high osmolarity (Quintero-Moreno et
al., 2005) to evaluate the functional
integrity of PM and/or MA throughout
the process and thus establish if there is
a high percentage of viable sperm after
thawing (González-Villalobos, 2017;
Peris-Frau et al., 2020). Based on the
facts explained, it is intended to analyze
whether there is a close relationship
between the osmo-adaptation of recently
collected, refrigerated, thawed sperm
and the seminal quality of tropical sheep
breeders.
Materials and methods
Location and characterization
of the experimental area
The study was carried out at the
Centro Experimental de Producción
997
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
Materiales y métodos
Ubicación y caracterización
del área experimental
El estudio fue realizado en el
Centro Experimental de Producción
Animal (CEPA-LUZ), ubicado en el km
25 a la vía a Perijá, municipio Cañada
de Urdaneta, estado Zulia. Zona
agroecológicamente caracterizada
como bosque seco tropical, a 80 msnm
con temperatura anual entre 29,5 y 34
ºC (Ewel et al., 1968).
Unidades experimentales y
recolección/procesamiento del
semen
Se utilizaron muestras seminales
recién colectadas y criopreservadas de
cinco ovinos mestizos genéticamente
probados y de razas adaptadas a
condiciones tropicales (ovejos de pelo
con predominio West African, Dorper
y Santa Inés). Los eyaculados fueron
colectados los días martes y viernes entre
las 7:00 y 10:00 de la mañana, mediante
vagina articial temperada a 39 ºC,
durante cinco semanas consecutivas. Se
obtuvieron un total de 25 repeticiones de
los cinco ovejos reproductores adultos (5
x 5). Después de la evaluación seminal
de rutina (motilidad, masal e individual
y concentración espermática), las
muestras clasicadas como idóneas
para congelar fueron diluidas con
una metodología de un solo paso de
criopreservación, mezclando el semen
con una solución madre con 20 % de
yema de huevo, 60 % de agua estéril
bidestilada y 20 % del diluente comercial
Triladyl®.
El primer diluyente crioprotector
utilizado contenía yema de huevos
frescos de gallinas criollas. El 60 % de
Animal (CEPA-LUZ), located at
km 25 road to Perijá, Cañada de
Urdaneta municipality, state of Zulia.
Agroecologically characterized as a
tropical dry forest, at 80 meters above
sea level with an annual temperature
between 29.5 and 34 ºC (Ewel et al.,
1968).
Experimental units and semen
collection/processing
Freshly collected and cryopreserved
seminal samples from ve genetically
tested crossbred sheep and breeds
adapted to tropical conditions
(predominantly West African, Dorper
and Santa Inés hair sheep) were
used. The ejaculates were collected on
Tuesdays and Fridays between 7:00
and 10:00 in the morning, using an
articial vagina tempered at 39 ºC,
for ve consecutive weeks. A total of
25 repetitions were obtained from the
ve adult breeding sheep (5 x 5). After
routine seminal evaluation (motility,
mass and individual, and sperm
concentration), the samples classied
as suitable for freezing were diluted
with a one-step cryopreservation
methodology, mixing the semen with
a stock solution containing 20 % yolk.
egg, 60 % sterile double distilled
water and 20 % commercial diluent
Triladyl®.
The rst cryoprotective diluent used
contained fresh egg yolk from Creole
hens. Sixty percent sterile water was
taken from double-distilled diluents.
The second cryoprotectant used was
based on glycerol recommended for
freezing semen of smaller ruminants,
20 % Triladyl®. It was homogenized
slowly in a thermoset water bath at
38 ºC. After mixing the semen with
998
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
agua estéril fue tomada de diluentes
bidestílados. El segundo crioprotector
utilizado fue con base de glicerol
recomendado para la congelación de
semen de rumiantes menores, Triladyl®
al 20 %. Se homogenizó lentamente
en baño maría termoestable a 38 ºC.
Luego de mezclado el semen con esta
solución madre se efectuó el llenado de
las minipajuelas de 0,25 mL. Posterior
a este tiempo, se procedió a estabilizar
las muestras seminales envasadas a
5 ºC durante un mínimo de dos horas
y un máximo de tres, donde se obtuvo
una marcada reducción de movimiento
y minimización del gasto de energía,
tal como lo recomiendan Rodríguez-
Martínez (2000) y Vera-Muñoz (2008).
Al culminar esta estabilización
seminal, las minipajuelas fueron
congeladas por lotes, en cavas de anime
que contenían nitrógeno líquido (NL) en
un proceso que constaba de dos pasos.
Primeramente, se estabilizaron por 10
minutos en vapores de NL a 5 cm por
encima de la supercie, posteriormente
se sumergieron en el mismo a -196 ºC
y se almacenaron en un termo-tanque
(MVE®, Millenium).
Análisis del semen fresco,
refrigerado y congelado
Vitalidad espermática
Esta prueba se realizó colocando
una gota de 10 µL de semen fresco
diluido (1:400) en un portaobjeto a 38
ºC sobre una platina termorregulable,
incluyendo sobre esta gota de semen, 10
µL del colorante supravital EN; al cabo
de 30 seg se homogenizó suavemente y
se realizó un extendido no. Los frotis
se observaron en un microscopio óptico
a 1000X, cuanticando un total de 200
espermatozoides.
this stock solution, the 0.25 mL mini-
straws were lled. After this time,
the seminal samples packaged at 5 ºC
were stabilized for a minimum of two
hours and a maximum of three, where
a marked reduction in movement and
minimization of energy expenditure
was obtained, as recommended by
Rodríguez-Martínez (2000) and Vera-
Muñoz (2008).
Upon completion of this seminal
stabilization, the mini-straws were
batch frozen in styrofoam cellars
containing liquid nitrogen (NL) in
a two-step process. First, they were
stabilized for 10 minutes in NL vapors
at 5 cm above the surface, later they
were immersed in it at -196 ºC and
stored in a thermo-tank (MVE®,
Millenium).
Analysis of fresh, chilled and
frozen semen
Sperm vitality
This test was performed by
placing a 10 µL drop of diluted fresh
semen (1:400) on a slide at 38 °C on
a thermoregulable stage, including on
this drop of semen, 10 µL of supravital
EN stain; after 30 sec it was gently
homogenized and a ne spread was
made. The smears were observed
in an optical microscope at 1000X,
quantifying a total of 200 spermatozoa.
Morphological abnormalities
With the same smear made to assess
sperm vitality, the morphoanomalies
of the freshly collected, refrigerated
and cryopreserved seminal samples
were quantied. For this, the
cells were classied according to
their appearance into normal and
abnormal, and expressed as a
percentage (%).
999
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
The latter: head defects (number,
size and appearance), intermediate
piece defects (location and
appearance), abnormalities in the
agellum (number, shape and size),
as well as signs of immaturity in the
form of the presence of a proximal
cytoplasmic drop (GCP) and distal
(GCD).
Acrosome evaluation
To visualize its appearance, a
simple technique with EN was used to
assess the apical part of the acrosome
in sperm, as has been documented
in previous experiences with sperm
from bulls (Rubio-Guillén, 2006), pigs
(Quintero-Moreno et al, 2004), sheep
(Rubio-Guillén et al., 2013) and goats
(Rubio-Guillén et al., 2014a).
This test was performed on fresh,
chilled and thawed semen. Presence of
intact acrosome (NAR) was observed
and when it was absent or altered
it was counted as altered acrosome
(Damage Apical Ridge), and when it
was absent it was quantied as MAR
(Missing Apical Ridge). The nal
result of NAR, DAR and MAR was
expressed as a percentage (%).
Modified Endosmosis Test
(HOST-EN)
The HOST-EN test was performed
by
subjecting a 50 μL sample of
fresh, chilled and thawed semen to
two hyposmotic media, the rst was
154 mOsm.L
-1
, and the second was
102 mOsm.L
-1
, for both. In cases, the
incubation was for 30 minutes, in 1.5
mL eppendorf tubes where 500 μL
of these hyposmotic solutions were
added, tempered in a water bath at
38 ºC. After this incubation time, the
sperm were counted up to a total of
Anormalidades morfológicas
Con el mismo frotis hecho para
valorar la vitalidad espermática se
cuanticaron las morfoanomalías
de las muestras seminales
recién recolectadas, refrigeradas
y criopreservadas. Para esto,
las células fueron clasicadas
según su apariencia en normales
y anormales, y expresados en
porcentaje (%). Estos últimos:
defectos de cabeza (número, tamaño
y apariencia), defectos de la pieza
intermedia (ubicación y apariencia),
anormalidades en el agelo (número,
forma y tamaño), así como signos de
inmadurez en forma de presencia de
gota citoplasmática proximal (GCP)
y distal (GCD).
Evaluación del acrosoma
Para visualizar su apariencia
se utilizó una técnica sencilla con
EN para valorar la parte apical
del acrosoma en espermatozoides,
tal como se ha documentado en
experiencias previas en espermio de
toros (Rubio-Guillén, 2006), cerdos
(Quintero-Moreno et al, 2004),
ovinos (Rubio-Guillén et al., 2013)
y caprinos (Rubio-Guillén et al.,
2014a).
Esta prueba fue realizada
al semen fresco, refrigerado y
descongelado. Se observó presencia
del acrosoma intacto (NAR) y
cuando el mismo estuvo ausente,
o alterado se contabilizó como
acrosoma alterado (Damage Apical
Ridge), y cuando estaba ausente fue
cuanticado como MAR (Missing
Apical Ridge). El resultado nal de
NAR, DAR y MAR se expresó en
porcentaje (%).
1000
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
Prueba de Endosmosis
modificada (HOST-EN)
La prueba HOST-EN se realizó
sometiendo una muestra de 50
μL de semen fresco, refrigerado
y descongelado a dos medios
hiposmóticos, el primero, fue de
154 mOsm.L
-1
, y el segundo de 102
mOsm.L
-1
, para ambos casos la
incubación fue durante 30 minutos, en
tubos eppendorf de 1,5 mL donde se
agregaban 500 μL de estas soluciones
hiposmóticas, temperadas en un baño
de maría a 38 ºC. Transcurrido este
tiempo de incubación, se contaron los
espermatozoides hasta un total de
100, observando la reacción positiva
(gura 1; tomada de Rubio-Guillén
et al., 2014a). Se categorizaron
las muestras evaluadas en cuatro
categorías, expresadas en porcentaje
(%), tal como se explica:
Espermatozoides no coloreados con
eosina (VIVOS) y agelos enrollados
(+HOST).
Espermatozoides coloreados
con eosina (MUERTOS) y agelos
enrollados (+HOST).
Espermatozoides no coloreados
con eosina (VIVOS) y agelos no
enrollados (-HOST).
Espermatozoides coloreados con
eosina (MUERTOS) y agelos no
enrollados (-HOST).
Osmotic resistance test
(ORT)
Prueba de resistencia
osmótica (ORT)
En un baño de maría a 38 ºC (tubo
de 1,5 mL) se incubó una alícuota de
50 μL del semen fresco, refrigerado
y descongelado durante 30 minutos
en un medio hiposmótico (ORT) de
100, observing the positive reaction
(Figure 1; taken from Rubio-Guillén
et al., 2014a). The samples evaluated
were categorized into four categories,
expressed as a percentage (%), as
explained:
Spermatozoa not stained with eosin
(LIVE) and coiled agella (+HOST).
Eosin-stained sperm (DEAD) and
coiled agella (+HOST).
Spermatozoa not stained with
eosin (LIVE) and agella not coiled
(-HOST).
Eosin-stained sperm (DEAD) and
unrolled agella (-HOST).
Osmotic resistance test (ORT)
In a 38 ºC water bath (1.5 mL tube),
a 50 μL aliquot of fresh, refrigerated
and thawed semen was incubated for
30 minutes in a hyposmotic medium
(ORT) of 154 mOsm.L
-1
. A small drop
was taken and mixed gently with 10 µL
of the EN dye. In the light microscope,
100 sperm were counted and the
acrosomic reactions already described
(DAR and MAR) were observed.
In the present study, a slight
modication was made to the initial
test described by Schilling and
Vengust (1985), obviating the gentle
centrifugation step to concentrate
sperm. Two aliquots of 50 μL fresh,
chilled or thawed semen were taken.
One of the samples was placed in 500
μL of the hyposmotic medium (102
or 154 mOsm.L
-1
) and the other, in a
control. After incubating the samples,
the stained smears were evaluated
in an optical microscope and directly
on the slide, the spermatozoa were
counted up to a total of 100, observing
the number of altered acrosomes (MAR
or DAR, gure 2; Rubio-Guillen et al.,
1001
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
154 mOsm.L
-1
. Una pequeña gota
fue tomada y mezclaba suavemente
con 10 µL del colorante EN. En el
microscopio óptico, se contaban 100
espermatozoides y se observaron las
reacciones acrosómicas ya descritas
(DAR y MAR).
A
B
Figura 1. A. Representación esquemática de espermatozoides
reaccionados positivamente a la prueba. B. Espermatozoides
de rumiantes reaccionados a la prueba (Enrollados).
Figure 1. A. Schematic representation of spermatozoa reacted positively
to test. B. Sperm from ruminants reacted to test (Coiled).
En el presente estudio, se realizó
una modicación leve a la prueba
inicial descrita por Schilling y
Vengust (1985), obviando el paso de
centrifugado suave para concentrar
espermatozoides. Se tomaron dos
alícuotas de semen fresco, refrigerado
o descongelado de 50 μL. Una de las
muestras se colocó en 500 μL del medio
hiposmótico (de 102 ó 154 mOsm.L
-1
)
y la otra, en un testigo. Luego de
incubar las muestras, los frotis teñidos
se evaluaron en un microscopio óptico
y directamente sobre el portaobjetos
2012). The total DAR or MAR of the
hyposmotic medium and the isosmotic
medium was added, divided by two
and the nal result was obtained,
expressed as a percentage (% ORT =
(% DAR/MAR hyposmotic medium +
% DAR/MAR isosmotic medium)/2).
Statistic analysis
The variables (vitality, DAR, ORT,
HOST-EN) of the fresh semen samples
just collected, refrigerated and thawed
from each of the ve adult sheep were
evaluated using the General Linear
Model. When signicant effects of the
independent variables were found on
the dependent variables, the effect
was quantied using the LSMEANS
procedure. The mathematical model
used was:
Where:
Yijk = µ + Ti + A (T) j (i) + εijk
1002
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
se contaron los espermatozoides
hasta un total de 100, observando el
número de acrosomas alterados (MAR
o DAR, gura 2; Rubio-Guillen et al.,
2012). Se sumó el total de DAR o MAR
del medio hiposmótico y del medio
isosmótico, se dividió entre dos y se
obtuvo el resultado nal, expresado
en porcentaje (%ORT= (%DAR/MAR
medio hiposmótico + %DAR/MAR
medio isosmótico)/2).
Figura 2. Espermatozoides de rumiante teñidos con eosina-nigrosina (A:
espermatozoide con acrosoma intacto, B: espermatozoide con
pérdida del acrosoma).
Figure 2. Ruminant sperm stained with eosin-nigrosin (A: sperm with
intact acrosome, B: sperm with loss of acrosome).
Análisis estadístico
Las variables (vitalidad, DAR, ORT,
HOST-EN) de las muestras de semen
fresco recién recolectado, refrigerado
y descongelado proveniente de cada
uno de los cinco ovinos adultos, fueron
evaluadas utilizando el Modelo Lineal
General. Cuando se encontraron
Yijk = Response translated
into semen quality assessment
parameters, which included
assessment tests of the structural
integrity of the PM and MA (vitality
and DAR), and assessment tests of
the functional integrity of the MP
and MA (ORT and HOST-EN).
µ = general mean.
Ti = effect of the i-th treatment
(i = fresh/chilled/thawed semen).
A (T) j (i) = effect of the j-th ani
mal
nested within the i-th treatment.
εijk = experimental error, assumed
normal and independently distributed
with zero mean and variance σ
2
DNI ~
(0, σ
2
DNI).
The effect of anysosmosis and
seminal freezing (nesting the animal
1003
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
efectos signicativos de las variables
independientes sobre las dependientes,
se cuanticó el efecto mediante el
procedimiento LSMEANS. El modelo
matemático utilizado fue:
Yijk = µ + Ti + A (T) j (i) + εijk
Dónde:
Yijk
= Respuesta traducida en
parámetros de valoración de la calidad
seminal, que incluyeron pruebas de
valoración de la integridad estructural
de la MP y MA (vitalidad y DAR), y
pruebas de valoración de la integridad
funcional de la MP y MA (ORT y
HOST-EN).
µ = media general.
Ti = efecto del i-ésimo tratamiento
(i = semen fresco/refrigerado/
descongelado).
A(T)
j(i)
= efecto del j-ésimo
animal anidado dentro del i-ésimo
tratamiento.
εijk
= error experimental, asumido
normal e independientemente
distribuido con media cero y varianza
σ
2
DNI~(0,σ
2
DNI).
Se evaluó el efecto de la anisosmosis
y congelación seminal (anidando la
variable animal) sobre los parámetros
de integridad de la MP y MA. Los
datos fueron analizados mediante
el SAS (Statistical Analysis System
software 8.2), para Windows (SAS
Inst. Inc., Cary, NC. USA).
Resultados y discusión
Valoración de la calidad
seminal en las muestras frescas,
refrigeradas y descongeladas de
ovinos tropicales
Se presentaron un promedio de
motilidad individual progresiva,
variable) on the integrity parameters
of the MP and MA was evaluated.
The data were analyzed using SAS
(Statistical Analysis System software
8.2), for Windows (SAS Inst. Inc.,
Cary, NC. USA).
Results and discussion
Evaluation of semen quality in
fresh, chilled and thawed samples
of tropical sheep
There was an average of progressive
individual motility, measured
subjectively and for fresh semen of 76.02
%. The average volume of the ejaculates
was 0.84 mL, the concentration was
2.66 x 109 spz.mL
-1
and the percentage
of mass motility (1-5) was 4.05. The
general means (µ) and the standard
error (EE) of characteristics evaluated
in fresh, chilled and thawed semen of
sheep are shown in Table 1.
All the fresh seminal samples had a
pH close to neutrality with an average
of 7.61. These ve basic parameters
coincide in rank similarity with those
reported by other authors in different
latitudes (Anel et al., 2003; García,
2014; Yániz et al., 2015), even with
authors working in tropical areas
(Córdova-Izquierdo et al., 2008; Valdez,
2013; Vargas, 2015). Sheep have a low-
volume ejaculate with a high sperm
concentration that allows AI to work
with mini-straws with doses ranging
between 20 and 200 million per dose
(Valdez, 2013). In this case, the dilution
was made based on 50 x 10
6
.dose
-1
,
similar to that reported in other trials
(Valdez, 2013).
DAR (%): porcentaje de acrosomas
reaccionados o alterados. MAR (%):
1004
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
medida subjetivamente y para el
semen fresco de 76,02 %. El volumen
promedio de los eyaculados fue de 0,84
mL, la concentración de 2,66 x 10
9
spz.
mL
-1
y el porcentaje de motilidad masal
(1-5) de 4,05. Las medias generales
(µ) y el error estándar (EE) de las
características evaluadas en semen
fresco, refrigerado y descongelado de
los ovinos se muestran en el cuadro 1.
Todas las muestras seminales en
fresco tuvieron un pH cercano a la
neutralidad con 7,61 de promedio.
Estos cinco parámetros básicos
coinciden en similitud de rango, con
los reportados por otros autores en
distintas latitudes (Anel et al., 2003;
García, 2014; Yániz et al., 2015),
inclusive con autores trabajando en
zonas tropicales (Córdova-Izquierdo et
al., 2008; Valdez, 2013; Vargas, 2015).
Los ovinos cuentan con un eyaculado
bajo en volumen y de alta concentración
espermática que permite trabajar
la IA con minipajuelas con dosis que
oscilan entre 20 y 200 millones por
dosis (Valdez, 2013). En este caso, la
dilución fue hecha en base a 50 x10
6
.
dosis
-1
, similar a lo reportado en otros
ensayos (Valdez, 2013).
Se observó el efecto detrimental del
proceso de criopreservación seminal
sobre los parámetros de evaluación
de la calidad espermática (P<0,01),
encontrándose disminución progresiva
del porcentaje de vitalidad durante el
enfriamiento de 73,02 a 50,25 % y luego
por la criopreservación propiamente
dicha 24,59%, presentándose
diferencias (P<0,001) cuanticables
entre los tres tratamientos; mientras
que el porcentaje de acrosomas
dañados fue de 18,60 % (reejados en
porcentaje de acrosomas reaccionados
o alterados. NAR (%): porcentaje
de acrosomas no reaccionados o
alterados. Total anormalidades (%):
incluye las morfoanomalías de la
cabeza y agelo espermático. ORT
(%): espermatozoides reaccionados
a la prueba de resistencia osmótica.
HOST+EN- (%): espermatozoides
positivos a la prueba de endósmosis.
The detrimental effect of the
seminal cryopreservation process
on the sperm quality evaluation
parameters (P<0.01) was observed,
nding a progressive decrease in the
percentage of vitality during cooling
from 73.02 to 50.25 % and then by the
cryopreservation itself 24.59 %, with
quantiable differences (P <0.001)
between the three treatments; while
the percentage of damaged acrosomes
was 18.60 % (reected in DAR (3.94
%) and MAR (14.72 %) for the newly
collected ejaculates and DAR of 14.36
% and 16.44 % for the refrigerated and
cryopreserved semen, respectively.
When describing the treatments
carried out in this trial (freshly
collected, refrigerated, thawed) it is
important to note that ruminant sperm
are especially sensitive to cold damage
(Hammerstedt et al., 1990), and in the
case of bulls and rams, is probably due
to an unsuitable relationship between
cholesterol and phospholipids (Vera-
Muñoz, 2008), as well as a lower ratio
of polyunsaturated/saturated fatty
acids in their PM, when compared
to species such as rabbit, man or
dog (Giraud et al., 2000). For this
reason, steps such as the addition of
the cryoprotectant, cooling, freezing,
storage in liquid nitrogen and thawing
1005
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
DAR (3,94 %) y MAR (14,72 %) para
los eyaculados recién recolectados
y DAR de 14,36 % y 16,44 % para el
semen refrigerado y criopreservado,
respectivamente.
Al describir los tratamientos
realizados en este ensayo (recién
recolectado, refrigerado, descongelado)
es importante destacar que, los
espermatozoides de rumiantes son
especialmente sensibles al daño por
frío (Hammerstedt et al., 1990), y
para el caso del toro y el morueco,
probablemente se deba a una
relación no idónea entre colesterol
y fosfolípidos (Vera-Muñoz, 2008),
así como, una menor relación ácidos
cause a greater deterioration in PM
and MA (Zhu and Liu, 2000; Utt,
2015), which is observed reected in
this trial by reporting a decrease in
individual motility and vitality upon
thawing (Foote and Parks, 1993;
Guillaume et al., 2004).
Parameters as important as VIT
(73.02 % vs. 50.25 % vs. 24.59 %)
and NAR (81.68 % vs. 53.28 % vs.
23.80 %) substantially worsened
when increasing the cold level (fresh
vs chilled vs defrosted), respectively.
Some authors comment that just
by diluting the samples to start
cryoprocessing, the percentage of
live spermatozoa can be affected
Cuadro 1. Características generales (µEE) en el semen fresco, refrigerado
y descongelado de ovinos tropicales.
Table 1. General characteristics (µEE) in fresh, chilled and thawed
semen of tropical sheep.
Características 5HFLpQUHFROHFWDGR Refrigerado Descongelado
Vitalidad (%) 73,02 ± 1,79
a
50,25 ± 2,78
b
24,59 ± 1,39
c
DAR (%) 3,94 ± 1,02
b
14,36 ± 2,25
a
16,44 ± 1,11
a
MAR (%) 14,72 ± 1,83
c
32,37 ± 4,03
b
59,72 ± 1,99
a
NAR (%) 81,68 ± 1,54
a
53,28 ± 3,38
b
23,80 ± 1,67
c
Total gotas (%) 0,10 ± 0,03
a
0,11 ± 0,07
a
0,03 ± 0,03
a
Cabeza Anormal (%) 5,60 ± 1,17
b
10,95 ± 2,59
a
10,92 ± 1,27
a
ORT (%) 80,91 ± 0,09
a
74,55 ± 1,90
b
68,88 ± 1,07
b
HOST+EN- (%) 75,27 ± 1,42
a
48,52 ± 3,13
b
26,78 ± 1,55
c
Valores entre paréntesis denotan intervalos de conanza de la variable estudiada
DAR (%): porcentaje de acrosomas reaccionados o alterados. MAR (%): porcentaje de acrosomas reaccionados
o alterados. NAR (%): porcentaje de acrosomas no reaccionados o alterados. Total anormalidades (%): incluye
las morfoanomalías de la cabeza y agelo espermático. ORT (%): espermatozoides reaccionados a la prueba
de resistencia osmótica. HOST+EN- (%): espermatozoides positivos a la prueba de endósmosis.
a,b,c
Letras
diferentes denotan diferencias estadísticas signicativas (P<0,001).
Values in parentheses denote condence intervals of the variable studied
DAR (%): percentage of reacted or altered acrosomes. MAR (%): percentage of reacted or altered acrosomes. NAR
(%): percentage of unreacted or altered acrosomes. Total abnormalities (%): includes head morphoanomalies
and spermatic agellum. ORT (%): sperm reacted to the osmotic resistance test. HOST+EN- (%): positive
sperm to endosmosis test.
a, b, c
Different letters denote statistically signicant differences (P <0.001).
Característcas
1006
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
grasos polinsaturados/saturados en su
MP, si se comparan con especies como
el conejo, hombre o perro (Giraud
et al., 2000). Por esta razón, pasos
como la adición del crioprotector,
el enfriamiento, la congelación, el
almacenamiento en nitrógeno líquido y
la descongelación causan un deterioro
mayor en la MP y MA (Zhu y Liu,
2000; Utt, 2015), lo cual se observa
reejado en este ensayo al reportarse
una disminución de la motilidad
individual y vitalidad al descongelado
(Foote y Parks, 1993; Guillaume et al.,
2004).
Parámetros tan importantes
como la VIT (73,02 % vs. 50,25 %
vs. 24,59 %) y el NAR (81,68 % vs.
53,28 % vs. 23,80 %) empeoraron
sustancialmente al incrementar el
nivel de frío (fresco, vs refrigerado
vs descongelado), respectivamente.
Algunos autores comentan que
con solo diluir las muestras para
comenzar el crioprocesado, se puede
afectar hasta un 30% el porcentaje
de espermatozoides vivos, en
lo que se llama “efecto dilutor”
(Leahy et al., 2010), sin contar el
bien conocido “estrés por frio” que
puede ocurrir cuando las muestras
son llevadas de 38 a 5ºC para su
estabilización (Vera-Muñoz, 2001;
Córdova-Izquierdo et al., 2008) o
el paso por el punto de congelación
en el descenso térmico desde 5
hasta el -196 ºC de la temperatura
de permanencia en NL “fase de
transición termotrópica”, donde
puede ocurrir un daño subletal
sobre todo en la MA, producto de
la crioinjuria (Varisli et al., 2009;
Valdez, 2013).
by up to 30 %, in what is called the
“dilutor effect” (Leahy et al., 2010),
not counting the well-known “Cold
stress” that can occur when the
samples are brought from 38 to 5 ºC
for their stabilization (Vera-Muñoz,
2001; Córdova-Izquierdo et al., 2008)
or the passage through the freezing
point in the thermal decrease from
5 up to -196 ºC of the temperature
of permanence in NL “thermotropic
transition phase”, where a sublethal
damage can occur especially in the
MA, product of cryoinjuria (Varisli et
al., 2009; Valdez, 2013).
The seminal freezing protocol was
done in a single step, unlike many
authors who work with the two-step
technique (Anel et al., 2003; Yániz et
al., 2015). The problem of glycerization
at laboratory temperature (25 °C)
is the effect on post-thaw sperm
viability, due to the toxic effects that
have been reported for a long time
(Rodríguez-Martínez, 2000). However,
working in this way and quickly
allows greater stabilization in the
nal freezing container in NL, which
avoids changes in temperatures in the
artisanal lling and stamping, after
the seminal samples have already
been cooled. In cold stress (5 ºC), the
main changes include reduced motility
and morphological integrity of the
sperm (García, 2014). These changes
contribute to the accumulation of
toxic metabolic products, mainly
reactive oxygen species formed by
the peroxidation of the membranes
(Córdova-Izquierdo et al., 2008).
In the case of MAR in the 32.37
% chilled and thawed semen (MAR:
59.72 %), this variable is affected by
1007
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
El protocolo de congelación seminal
se hizo a un solo paso a diferencia de
muchos autores que trabajan con
la técnica de dos pasos (Anel et al.,
2003; Yániz et al., 2015). El problema
de la glicerización a temperatura de
laboratorio (25°C) es la afectación
de la viabilidad espermática post-
descongelación, debido a los efectos
tóxicos que han sido reportados
desde hace mucho tiempo atrás
(Rodríguez-Martínez, 2000). Sin
embargo, trabajar así y de manera
rápida permite mayor estabilización
en el recipiente nal de congelación
en NL, lo que evita los cambios de
temperaturas en el llenado y timbrado
artesanal, luego que ya han sido
enfriadas las muestras seminales. En
el estrés por frio (5 ºC), los principales
cambios incluyen reducción de la
motilidad e integridad morfológica del
espermatozoide (García, 2014). Estos
cambios contribuyen a la acumulación
de productos tóxicos del metabolismo,
principalmente especies reactivas de
Oxigeno formados por la peroxidación
de las membranas (Córdova-Izquierdo
et al., 2008).
Para el caso de los MAR en el semen
refrigerado de 32,37 % y descongelado
(MAR: 59,72 %), se ve afectada
esta variable por el daño criogénico
producido a las muestras procesadas.
Lo anterior indica, que el porcentaje
de NAR disminuyó abruptamente de
81,68 % a 32,37 % con el daño por frio,
y posteriormente desciende a 23,80 %
al ser congelado en NL; estos valores
son similar a lo reportado para ovinos
de pelo en condiciones tropicales
(Vargas, 2015). Pursel y Johnson
(1974) plantearon por primera vez
the cryogenic damage produced to
the processed samples. The foregoing
indicates that the percentage of NAR
decreased abruptly from 81.68 % to
32.37 % with the cold damage, and
later it drops to 23.80 % when frozen in
NL; These values are similar to those
reported for hair sheep in tropical
conditions (Vargas, 2015). Pursel
and Johnson (1974) proposed for the
rst time that AM could be affected
by cryopreservation action, however,
the structural integrity of PM could
not be damaged (Zhu and Liu, 2000),
suggesting that the damage of each
domain of PM can occur independently
(Chan et al., 1991; Peris-Frau et al.,
2020).
During the cryo-capacitation that
can occur in the cryogenic processing
of the samples, the proteins within the
PM of the sperm migrate thanks to
the loss of intramembrane cholesterol,
thus forming domains with or without
the latter (Vera-Muñoz, 2001). In
areas where there are no proteins,
the MP and MA will fuse. This fusion
begins the exocytosis process of AM
(Dacheux and Dacheux, 2001).
The ability of the sperm to perform
this acrosome reaction, in response
to contact with the zona pellucida,
can be used as an indication of sperm
fertility (Dzuik, 1996; Utt, 2015).
In eutherian mammalian sperm, it
has been postulated that premature
acrosome loss prevents sperm-oocyte
fusion (Yanagimachi, 1994; Peris-
Frau et al., 2020). Only spermatozoa
that can perform the acrosomal
reaction in synchronization with the
penetration phase of the oocyte, have
the ability to pass through the zona
1008
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
que la MA podría afectarse por acción
de la criopreservación, no obstante,
la integridad estructural de la MP
podría no sufrir daño (Zhu y Liu,
2000), sugiriendo que el daño de cada
dominio de la MP puede producirse de
manera independiente (Chan et al.,
1991; Peris-Frau et al., 2020).
Durante la criocapacitación que
puede ocurrir en el procesado criogénico
de las muestras, las proteínas dentro
de la MP del espermatozoide migran
gracias a la perdida de colesterol
intramembrana, formando así
dominios con o sin estas últimas (Vera-
Muñoz, 2001). En las zonas donde no
hay proteínas se fusionará la MP y la
MA. Esa fusión comienza el proceso
de exocitosis de la MA (Dacheux y
Dacheux, 2001).
La habilidad del espermatozoide
para realizar esta reacción del
acrosoma, en respuesta al contacto
con la zona pelúcida, puede ser
utilizada como un indicativo de
fertilidad del espermatozoide (Dzuik,
1996; Utt, 2015). En espermatozoides
de mamíferos euterianos se ha
postulado que, la pérdida prematura
del acrosoma, previene la fusión
del espermatozoide con el ovocito
(Yanagimachi, 1994; Peris-Frau et al.,
2020). Sólo los espermatozoides que
pueden realizar la reacción acrosomal
de manera sincronizada con la fase
de penetración del ovocito, tienen
la habilidad de pasar a través de la
zona pelúcida y, como consecuencia,
fusionarse con este, para formar
un embrión (Tesarik et al., 1993;
Januskauskas y Rodríguez-Martínez.,
2000). Aunque en ratones, se ha
demostrado, como espermatozoides
pellucida and, as a consequence, fuse
with it, to form an embryo (Tesarik
et al., 1993; Januskauskas and
Rodríguez-Martínez., 2000). Although
in mice, it has been shown that
sperm with acrosomal reaction prior
to contact with ZP3 have an afnity
for penetration to this glycoprotein
membrane (Jin et al., 2011).
In light of the ndings made in
sheep, the idea is still maintained
that any damage to the MA would
cause its contentive enzymes to be
released, preventing fertilization,
so that, as mentioned above, if the
percentage of these alterations is
high, it can cause a decrease in
fertility (Rubio-Guillén, 2006; Díaz
et al., 2012; Chen et al., 2019).
Furthermore, if it is known that this
structure is one of the most affected
after cryopreservation (Hammersedt
et al., 1990; Rubio-Guillén et al.,
2009; Díaz et al., 2012; Hernández et
al., 2012).
Ejaculates in which a large part of
the sperm have lost their acrosomes
will show lower fertility (Rubio-
Guillén, 2006; Díaz et al., 2012;
Utt, 2015). In cattle experiments,
the induction of the acrosome
reaction with the ionophore A23187
was marginally correlated with in
vivo fertility (Januskauskas et al.,
2000). It can be hypothesized that
the length of the sperm head may
be related to the presence of an
intact acrosome (Chen et al., 2019).
In contrast, it has been correlated
with the sperm morphometry of
subpopulations that showed high
fertility, when compared with their
contemporaries who presented
1009
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
con reacción acrosomal previa al
contacto con la ZP
3
presentan anidad
por penetración a esta membrana
glicoprotéica (Jin et al., 2011).
A la luz de los hallazgos hechos
en ovinos, se sigue manteniendo la
idea que, cualquier daño en la MA
provocaría que se liberen sus enzimas
contentivas, impidiendo la fecundación,
de forma que, como se mencionó
anteriormente, si el porcentaje de
estas alteraciones es elevado, puede
provocar un descenso de la fertilidad
(Rubio-Guillén, 2006; Díaz et al.,
2012; Chen et al., 2019). Más aún, si
se sabe que esta estructura es una de
las mayormente afectadas luego de la
criopreservación (Hammersedt et al.,
1990; Rubio-Guillén et al., 2009; Díaz
et al., 2012; Hernández et al., 2012).
Los eyaculados en los que gran parte
de los espermatozoides han perdido sus
acrosomas mostraran menor fertilidad
(Rubio-Guillén, 2006; Díaz et al.,
2012; Utt, 2015). En experiencias con
vacunos, la inducción de la reacción
acrosómica con el ionóforo A23187 fue
correlacionada marginalmente con
la fertilidad in vivo (Januskauskas et
al., 2000). Se puede hipotetizar que el
largo de la cabeza espermática puede
ser relacionado con la presencia de un
acrosoma intacto (Chen et al., 2019).
En contraparte, se ha correlacionado
con la morfometría espermática de
subpoblaciones que mostraron una
fertilidad alta, al compararlo con sus
coetáneos que presentaban fertilidades
medias y bajas (Rubio-Guillén, 2006).
Efecto del cambio de
osmolaridad sobre la MA y MP
En el cuadro 2, se pudo evaluar el
resultado de las pruebas de resistencia
medium and low fertility (Rubio-
Guillén, 2006).
Effect of the change in
osmolarity on MA and MP
In Table 2, it was possible to
evaluate the result of the osmotic
resistance tests on the structural and
functional integrity of MP and MA in
various anysosmosis conditions (with
emphasis on 154 and 102 mOsm.L
-1
).
In the case of structural integrity,
a marked effect of cryoprocessing
was seen between fresh and thawed
samples of all osmolar categories (VIT
and DAR; P <0.001). Also nding
signicant statistical differences
(P <0.001) between isosmolar vs.
hyposmotic. From 79 % VIT for fresh
semen, a detriment of 9 % was evidenced
in the 154 mOsm.L
-1
anysosmotic
condition and up to 16 % for the
102 mOsm.L
-1
osmolar condition. In
contrast, cryopreserved semen did not
show an apparent decrease between
hyposmolar treatments (P> 0.01).
For all test results, no differences (P>
0.01) were found between the control
samples (undiluted) and those diluted
in an isosmolar incubation medium of
308 mOsm.L
-1
; same evidence, when
comparing fresh and cryopreserved
samples incubated in hyposmotic
conditions of 102 mOsm.L
-1
vs. 154
mOsm.L
-1
.
Regarding the evaluation of the
functionality of the MP and MA, of the
two tests carried out in this experiment
HOST-EN and ORT, only the ORT
did not present highly signicant
differences (P> 0.01), although its
numerical differences were notable;
between refrigerated and thawed
semen (74.55 % vs. 68.88 %; P> 0.05).
1010
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
osmótica sobre la integridad estructural
y funcional de MP y MA en varias
condiciones de anisosmosis (con énfasis
en 154 y 102 mOsm.L
-1
). Para el caso
de la integridad estructural se vio
un efecto marcado del crioprocesado
entre las muestras frescas y
descongeladas de todas las categorías
osmolares (VIT y DAR; P<0,001).
Encontrándose así mismo, diferencias
estadísticas signicativas (P<0,001)
entre los tratamientos isosmolares
vs. hiposmóticos. Desde un 79 % de
VIT para el semen fresco se evidenció
un detrimento de 9 % en la condición
anisosmótica de 154 mOsm.L
-1
y de
hasta 16 % para la condición osmolar
de 102 mOsm.L
-1
. En contraparte, el
semen criopreservado no evidenció
disminución aparente entre los
tratamientos hiposmolares (P>0,01).
Para todos los resultados de las pruebas
no se encontraron diferencias (P>0,01)
entre las muestras control (sin diluir) y
las diluidas en un medio de incubación
isosmolar de 308 mOsm.L
-1
; misma
evidencia, al comparar las muestras
frescas y criopreservadas incubadas
en condiciones hiposmóticas de 102
mOsm.L
-1
vs. 154 mOsm.L
-1
.
En cuanto a la evaluación de la
funcionalidad de la MP y MA, de las dos
pruebas realizadas en este experimento
HOST-EN y ORT, solo el ORT no presentó
diferencias altamente signicativas
(P>0,01), aunque sus diferencias
numéricas fueron notables; entre el
semen refrigerado y descongelado (74,55
% vs. 68,88 %; P>0,05). En oposición,
el HOST presentó una disminución
detectable estadísticamente (P<0,001)
entre los tres tratamientos realizados,
quedando como sigue: HOST (75,27
In contrast, the HOST presented a
statistically detectable decrease (P
<0.001) among the three treatments
performed, being as follows: HOST
(75.27 % vs. 48.52 vs. 26.78 %) for the
freshly collected, refrigerated semen
and thawed, respectively. Sperm
functionality in terms of resistance
to anysosmotic incubation has been
shown to correlate with in vitro
fertility (Jeyendran et al., 1984), as
well as with the fertility of ruminant
females (Rubio-Guillén, 2006).
As some authors (Zhu and Liu,
2000; Peris-Frau et al., 2020) have
postulated that the structural and
functional damage of the sperm
membrane domains can occur
individually and not dependently,
in this trial, tests were performed
structural (NAR) and functional
(ORT) assessment of MA and MP (VIT
and HOST-EN). All this, looking for a
unique test that could evaluate various
aspects related to semen quality and
correlate them with in vivo fertility
(Rubio-Guillén et al., 2014b).
Two hyposmotic conditions were
used in this study (102 and 154
mOsm.L
-1
) in search of differences in
resistance to anysosmosis and for the
detection of false negatives, since it
has been published that hyposmolar
conditions are recommended for
sheep. lower than in large ruminants
(Anel et al., 2003). However, under
the conditions in which this test was
carried out, no statistically signicant
differences (P> 0.001) were observed
between both conditions for any of the
three treatments. Reliable conclusion
that allows the use of both osmolarities
to observe the response to hyposmotic
1011
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
% vs. 48,52 vs. 26,78 %) para el semen
recién recolectado, refrigerado y
descongelado, respectivamente. La
funcionalidad espermática en términos
de resistencia a incubación anisosmótica
ha sido demostrada que presenta una
correlación con la fertilidad in vitro
(Jeyendran et al., 1984), así como
también con la fertilidad de hembras
rumiantes (Rubio-Guillén, 2006).
incubation, without detriment to the
response due to the appearance of
false negatives. For this reason, in
sheep this test is still used today, as
a faithful estimator of the functional
integrity of the PM, as shown by some
studies (Valdez, 2013; García, 2014).
In ruminants, high and positive
correlations have been reported
between HOST and the percentage
Cuadro 2. Efecto del estrés anisosmótico sobre la integridad estructural
y funcional de la membrana plasmática y acrosomal de
espermatozoides ovinos.
Table 2. Effect of anysosmotic stress on the structural and functional
integrity of the plasma and acrosomal membrane of sheep
spermatozoa.
Parámetro Osmolaridad (mOsm.L
-1
)
7HVWLJR 102
Vitalidad (%)
Fresco 79,42
a
± 2,56 79,31
a
± 2,56 70,38
ab
± 2,60 62,97
b
± 2,56
Descongelado 31,81
a
± 2,74 23,31
a
± 2,79 22,60
a
± 2,69 20,66
a
± 2,90
Crioinjuria -47,61* -56* -47,78* -42,31*
NAR (%)
Fresco 86,31
a
± 3,06 85,29
a
± 3,05 80,39
a
± 3,10 74,73
a
± 3,05
Descongelado 32,98
a
± 3,27 33,05
a
± 3,39 19,91
ab
± 3,26 9,25
b
± 3,46
Crioinjuria -53,33* -52,24* -60,48* -65,40*
HOST+EN- (%)
Fresco 76,44
a
± 2,83 74,61
a
± 2,83 77,19
a
± 2,82 72,86
a
± 2,82
Descongelado 29,13
a
± 3,02 28,32
a
± 3,13 24,76
a
± 3,02 24,92
a
± 3,20
Crioinjuria -47,31* -46,29* -52,43* -47,94*
ORT (%)
Fresco 86,38
a
± 1,97 86,30
a
± 1,96 70,00
b
± 2,00 63,55
b
± 1,96
Descongelado 53,22
a
± 2,11 43,74
a
± 2,14 25,10
ab
± 2,06 29,47
b
± 2,22
Crioinjuria
-43,16* -42,56* -44,90* -34,08*
Los resultados son expresados en media aritmética ± desviación estándar para las muestras de semen
analizadas de los 5 ovinos. ORT (%): espermatozoides reaccionados a la prueba de resistencia osmótica. NAR
(%): Porcentaje de acrosomas normales en los espermatozoides evaluados. HOST+EN- (%): espermatozoides
positivos a la prueba de endósmosis y no teñidos con Eosina.
a,b,c
Letras diferentes en las las denotan diferencias estadísticas signicativas (P<0,01).
*Diferencias estadísticas signicativas (P<0,01) entre columnas denotando daño por congelación.
The results are expressed as arithmetic mean ± standard deviation for the analyzed semen samples from the 5
sheep. ORT (%): sperm reacted to the osmotic resistance test. NAR (%): Percentage of normal acrosomes in the
sperm evaluated. HOST+EN- (%): sperm positive to endosmosis test and not stained with Eosin.
a, b, c
Different letters in the rows denote statistically signicant differences (P <0.01).
* Signicant statistical differences (P <0.01) between columns denoting damage by freezing.
Parámetro
1012
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
Como algunos autores (Zhu y Liu,
2000; Peris-Frau et al., 2020) han
postulado que el daño estructural y
funcional de los dominios de membrana
del espermatozoide pueden ocurrir de
manera individual y no dependiente,
en este ensayo, se realizaron pruebas
de valoración estructural (NAR) y
funcional (ORT) de la MA y de la MP
(VIT y HOST-EN). Todo esto, buscando
una prueba única que pudiese evaluar
varios aspectos relacionados con
calidad seminal y correlacionarlos con
la fertilidad in vivo (Rubio-Guillén et
al., 2014b).
Dos condiciones hiposmóticas
fueron utilizadas en este estudio (102 y
154 mOsm.L
-1
) en busca de diferencias
en la resistencia a la anisosmosis y con
nes de detección de falsos negativos,
ya que ha sido publicado que para
ovinos son recomendables condiciones
de hiposmolaridad más bajas que en los
grandes rumiantes (Anel et al., 2003).
Sin embargo, en las condiciones en que
se realizó este ensayo no se observaron
diferencias estadísticas signicativas
(P>0,001) entre ambas condiciones
para ninguno de los tres tratamientos.
Conclusión fehaciente que permite
el uso de ambas osmolaridades para
observar la respuesta a la incubación
hiposmótica, sin detrimento de la
respuesta por aparición de falsos
negativos. Por esta razón, en ovinos
se sigue usando esta prueba hoy por
hoy, como un el estimador de la
integridad funcional de la MP, como lo
demuestran algunos estudios (Valdez,
2013; García, 2014). En rumiantes,
se han señalado correlaciones
altas y positivas entre el HOST y
el porcentaje de espermatozoides
vivos, la motilidad espermática,
el porcentaje de espermatozoides
normales y la fertilidad in vivo e in
vitro, tanto del semen fresco, como
para el descongelado (Anel et al., 2003;
Rubio-Guillén, 2006).
Conclusiones
El proceso de criopreservación
seminal altera la funcionalidad de una
of live sperm, sperm motility, the
percentage of normal sperm, and in
vivo and in vitro fertility, both for fresh
semen and for thawed semen (Anel et
al., 2003; Rubio-Guillén, 2006).
Conclusions
The seminal cryopreservation
process alters the functionality of
a large proportion of spermatozoa,
the acrosome being the structural
unit, which is mainly affected. The
anysosmotic incubation demonstrated
how the acrosome suffers considerably
in structural and functional integrity
(DAR and ORT), more than MP.
Recommendations
Considering the biological and
economic importance of knowing
accurately the potential fertility of
the ovine semen used in AI, it is
recommended to evaluate the seminal
samples obtained in this study, in eld
fertility (nulliparous females) or IVF
to better assess sperm quality.
End of English Version
1013
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
gran proporción de espermatozoides,
siendo el acrosoma la unidad
estructural, que principalmente es
afectada. La incubación anisosmótica
demostró como el acrosoma sufre
considerablemente en integridad
estructural y funcional (DAR y ORT),
más que la MP.
Recomendaciones
Considerando la importancia
biológica y económica que implica
conocer en forma certera la fertilidad
potencial del semen ovino utilizado
en la IA, se recomienda evaluar las
muestras seminales obtenidas en
este estudio, en fertilidad de campo
(hembras nulíparas) o FIV para
valorar mejor la calidad espermática.
Literatura citada
Anel, L., P. D. Paz, M. Álvarez, C. A. Chamorro,
J. C. Boixo, A. Manso, M. González,
M. Kaabi, M. and E. Anel. 2003. Field
and in vitro assay of three methods for
freezing ram semen. Theriogenology
60: 1293-1308.
Chan, P., D. R. Tredway, B. C. Su, J. Corselle
and S. Ren. 1991. Combined supravital
stains and hypoosmotic swelling test.
Human Reprod. 6(8): 1115-1118.
Chen, F., L., Gao, H., Zhou, L., Gou, Q., Chen,
Y., Gan, X., Sun, Q., Li, and K., Wrang.
2019. The association between sperm
head elongongation and semen quality.
Andrology 1-6.
Córdova-Izquierdo, A., M. Córdova-Jiménez,
C. Córdova-Jiménez y J. Guerra-Liera.
2008. Procedimientos para aumentar
el potencial reproductivo en ovejas y
cabras Rev. Vet. 19(1): 67-79.
Dacheux, F., and J. Dacheux. 2001.
L´épididyme et les glandes annexes. In:
La reproductionchez les mammifères
et l`Homme. Coordonnateurs: Charles
Thibault et Marieclaire Levasseur.
Ellipses Édition Marketing, S.A. INRA.
Paris, France. Chapitre 14: 455-468.
Díaz, A. R., F. Martínez-Pastor, E. Anel, M.
Álvarez, L. Anel, J. C. Boixo, J. D.
Muro y P. de Paz. 2012. Variación de
las técnicas de valoración acrosomal
en distintas fases de la conservación
de semen ovino. Producción ovina y
caprina N° XXVII SEOC: 1012-1015.
Dzuik, J. 1996. Factors that inuence the
proportion of offspring sired by a male
following heterospermic insemination.
Anim. Reprod. Sci. 43: 277-282.
Ewel, J., A. Madriz y A. Tosi. 1968. Zonas
de vida de Venezuela. 2da. Edición.
Editorial Sucre, Caracas. 65 p.
Foote, R. H. and J. E. Parks. 1993. Factors
affecting preservation and fertility of
bull semen: A brief review. Reprod.
Fert. Dev. 5: 665-673.
Garcia, W. 2014. Optimización de los protocolos
de criopreservación de semen ovino
de las razas autóctonas en peligro de
extinción Xisqueta y Aranesa. Tesis
Doctoral. Universidad Autónoma de
Barcelona. España. 315 p. https://ddd.
uab.cat/record/127501
Giraud, M., C. Motta, D. Boucher and G.
Grizard. 2000. Membrane uidity
predicts the outcome of criopreservation
of human spermatozoa. Human
Reproduction 15(10): 2160-2164.
Guillaume, M., O. Sabido, P. Durand and R.
Levy. 2004. Cryopreservation induces
an apoptosis-like mechanism in bull
sperm. Biol. Reprod. 71: 28-37.
González-Villalobos, D. 2017. Cinética
del espermatozoide de cerdo y su
utilidad como método de evaluación
de la calidad seminal. Trabajo de
Ascenso categoría de Profesor Titular.
Universidad del Zulia. Facultad de
Ciencias Veterinarias. Maracaibo,
Venezuela. 63 pp.
Hammerstedt, R. H., J. K. Graham and J.
P. Nolan. 1990. Cryopreservation of
mammalian sperm: what we ask them
to survive. J. Androl. 11: 73-88.
Hernández, P. J. E., R. F. Fernández, S. J.
L. Rodríguez, R. E. Juárez, M. Y. G.
Soto and R. A. D. García. 2012. Effect
1014
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
of cryopreservation of sheep semen
related to its viability and acrosomal
status. Rev. Salud Anim. 34(2): 78-83.
Januskauskas, A. and H. Rodríguez-Martínez.
2000. Assessment of sperm viability
by measurement of ATP, membrane
integrity and motility in frozen/thawed
bull semen. Acta Vet. Scand. 36: 571-
574.
Jeyendran, R. S., H. H. Van der Ven, M. Pérez-
Peláez, B. J. Crabo and L. J. Zaneveld.
1984. Development of an assay to asses
the functional integrity of the human
sperm membrane and its relationship
to other semen characteristics. J.
Reprod. Fertil. 70: 219-228.
Jin, M., E. Fujiwara, Y. Kakiuchi, M. Okabed,
Y. Satouh, S. Baba, K. Chiba and N.
Hirohashia. 2011. Most fertilizing
mouse spermatozoa begin their
acrosome reaction before contact with
the zona pellucida during in vitro
fertilization. PNAS 108(12): 4892-4896.
Leahy T., J. I. Marti, N. Mendoza, R. Pérez-
Pérez, T. Muino-Blanco, J. A. Cebrián-
Pérez, G. Evans and W. M. C. Maxwell.
2010. High pre-freezing dilution
improves post-thaw function of ram
spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 119:
137-146.
Nava-Trujillo, H., A. Quintero-Moreno, C.
Osorio, J. Rubio-Guillén, F. Carrillo
and G. Finol-Parra. 2012. Use of water
test to assess the sperm membrane
functional integrity in cryopreserved
bull semen. Rev. Científ. FCV-LUZ.
Vol. XXI (3): 211-214.
Peris-Frau, P., A., Soler, M., Iniesta, A.,
Martín, I., Sanchéz, D. Medina, M.,
Fernández and O., García. 2020.
Sperm cryodamage in rumiants:
Understanding the molecular changes
induced by the cryopreservation
process to optimize sperm quality. Int.
J. Mol. Sci.: 21: 2781-2008.
Pursel, V. G., L. A. Johnson. 1974.
Glutaraldehyde xation of boar
spermatozoa for acrosome evaluation.
Theriogenology. 1(2):63-68.
Quintero-Moreno, A., T. Rigau, J. E. Rodríguez-
Gil. 2004. Regression analyses and
motile sperm subpopulation structure
study as improving tools in boar semen
quality analyses. Theriogenology.
61:673-690.
Quintero, A., J. Rubio, T. Rigau y J. E. Rodríguez-
Gil. 2005. El test de resistencia
hiposmótica: un test promisorio para
medir la integridad de la membrana
espermática del cerdo. Maracaibo,
Venezuela. Arch. Lat. Prod. Anim. 4 p.
Quintero-Moreno A., J. Rubio-Guillén, D.
González-Villalobos, J. C. Gutiérrez,
N. Madrid-Bury, J. J. Garde. 2011.
Identication of cryodamage on plasma
membrane Integrity in bull spermatozoa
and its relationship with eld fertility.
Revista Cientíca, FCV-LUZ XXI. (5):
403-407.
Rodríguez-Martínez, H. 2000. Evaluación de
semen congelado: Métodos Tradicionales
y de actualidad. Internacional
Veterinary Inormation Service (www.
ivis.org), Ithaca, New Cork, USA.
Rubio-Guillén, J. 2006. Efecto del proceso
de criopreservación sobre la calidad
seminal y fertilidad de toros Holstein,
Brahman y sus mestizos. Tesis de
Maestría. Facultad de Agronomía,
Universidad del Zulia. 103 p.
Rubio-Guillén, J., D. González y A.
Quintero-Moreno. 2009. Efecto de la
criopreservación sobre la integridad de
la membrana plasmática y acrosomal de
espermatozoides de toros. Rev. Cient.
FCV-LUZ. XIX (4): 382-389.
Rubio-Guillén, J., O. Portillo-Guevara, M.
Montero, A. Velásquez, W. Zalahne,
D. González-Villalobos, P. Torres-
Rodríguez, A. Quintero-Moreno. 2013.
Integridad de la membrana plasmática
de espermatozoides recién colectados de
ovinos en condiciones de trópico seco.
XV Jornadas sobre Producción Animal.
AIDA. Tomo I: 407-409.
Rubio-Guillén, J., C. Osorio y L. Yamarte.
2014a. Innovadora prueba de
valoración seminal ovina utilizando
tres (3) test de fácil aplicación en
campo. 3er Congreso Venezolano de
Ciencia, tecnología e innovación. Del
27-29/11/14. Caracas, Venezuela.
Rubio-Guillén, J., A. Quintero-Moreno,
D. González y C. Osorio. 2014b.
Integridad estructural y funcional
de la membrana plasmática de
1015
Esta publicación científica en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(4): 993-1015. Octubre-Diciembre.
Rubio-Guillén et al. ISSN 2477-9407
espermatozoides recién colectados de
ovinos tropicales. II Encuentro Andino
de Ciencia, Tecnología e innovación.
Del 22-24/10/14. Mérida, Venezuela.
Rubio-Guillén, J., M. Montero, O. Portillo,
D. González, J. Aranguren-Méndez,
N. Madrid-Bury, Y. Villasmil y A.
Quintero-Moreno. 2012. Comparación
entre dos grupos raciales de ovinos
tropicales mediante pruebas de
viabilidad espermática. XIII Jornadas
Cientíco Técnicas de la Facultad
de Agronomía LUZ. 21-23/11/12.
Maracaibo, Venezuela. 55 p.
Rubio-Guillén, 2017. Efecto de la
criopreservación sobre la integridad
estructural y funcional de
espermatozoides ovinos tropicales.
Tesis Doctoral. Facultad de Agronomía
de la Universidad del Zulia. 137 p.
SAS Institute. 2000. SAS user guide: statics.
Versión 8.0 Edition SAS institute Inc.
Cary, NY. 530 p.
Schilling, E. and M. Vengust. 1985.
Determination of osmotic resistance of
boar spermatozoa and its relationship
with the storage ability of semen
samples. Zuchthygiene 20: 61-78.
Tesarik, J., C. Mendoza, J. P. Ramirez, J.
Moos. 1993. Solubilized human zona
pellucida competes with a fucosylated
neoglycoprotein for binding sites on
the human sperm surface. Fertility &
Sterility. 60(2): 344-350.
Utt, M. 2015 Prediction of bull fertility. Anim.
Reprod. Sci. Available in: http://dx.doi.
org/10.1016/j.anireprosci.2015.12.011
Valdez, D. 2013. Efecto del dodecil sulfato
ionico adicionado a un diluyente
libre de yema de huevo sobre la
calidad del semen congelado ovino.
Tesis de Maestría. Universidad de
Cuenca. Ecuador. 74 p. Disponible
en: http://dspace.ucuenca.edu.ec/
handle/123456789/500.
Vargas, P. 2015. Efecto del factor dilutor y
raza en la integridad de la membrana
espermática y acrosomal en semen
crioconservado de carneros. Tesis
de Grado a Médico Veterinario.
Universidad Nacional del Altiplano.
81 p. Disponible en: http://repositorio.
unap.edu.pe/handle/UNAP/2236.
Varisli O., C. Uguz, C. Agca and Y. Agca.
2009. Motility and acrosomal integrity
comparisons between electro-
ejaculated and epididymal ram sperm
after exposure to a range of anisosmotic
solutions, cryoprotective agents and
low temperatures. Anim. Reprod. Sci.
110: 256-268.
Vera-Muñoz, O. 2001. Evaluación seminal
comparativa pre y postcongelación
en machos bovinos. En: Reproducción
bovina. González-Stagnaro C. (Ed.).
Edics. Astro Data S.A. Fundación
GIRARZ. Maracaibo-Venezuela. Cap:
XII: 1-11.
Vera-Muñoz, O., 2008. Fisiología de los
espermatozoides bovinos. En:
Desarrollo sostenible de ganadería
doble propósito. Gonzalez-Stagnaro
C., E. Soto-Belloso (Eds.). Fundación
GIRARZ. Ediciones ASTRODA S.A.
Sección 5(40): 495-504.
Villasmil, Y., J. Aranguren, N. Madrid-Bury,
D. González, J. Rubio-Guillén, C.
González-Stagnaro, M. Portillo y F.
Yañez. 2011. Edad y peso a la pubertad
de ovinos cruzados en el Estado Zulia,
Venezuela. Actas Iberoamericanas de
Conservación Animal AICA. 419-422.
Yanagimachi, R. 1994. Mammalian
fertilization. In: Physiology of
reproduction. Knobil, E. and J.D. Neill
(Eds.). 2nd edition. Raven Press, New
York. p. 189-317.
Yániz, J. L., C. Soler, P. Recreo, T. Carretero
and A. Bono. 2015. Sperm population
structure in high and low eld fertility
rams. Anim. Reprod. Sci.156: 128-134.
Zhu, W. and X. Liu. 2000. Cryodamage to
plasma integrity in head and tail
region human sperm. Asian J. Androl.
2: 135-138.
