718
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(3): 718-732. Julio-Septiembre.
DOI: https://doi.org/10.47280//RevFacAgron(LUZ).v38.n3.14 ISSN 2477-9407
Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido el 04-09-2020 . Aceptado el 22-10-2020
*
Autor de correspondencia. Correo electrónico: palcivar4727@hotmail.com
Nota técnica / Technical note
Sacaricación y fermentación de los residuos
lignocelulósicos de la naranja para la obtención de
bioalcohol
Saccharication and fermentation of the lignocellulosic
residues of the orange to obtain bioalcohol
Sacaricação e fermentação dos resíduos lignocelulósicos
da laranja para obtenção de bioálcool
Pablo Enrique Alcívar-Mendoza
1,2*
; José Patricio Muñoz-
Murillo
2
; Christhel Alejandra Andrade-Díaz
2
y Alex Alberto
Dueñas-Rivadeneira
2
.
1
Maestría Académica con Trayectoria Profesional en Agroindustria- Instituto de
Posgrado.
2
Departamento de Procesos Agroindustriales, Facultad de Ciencias Zootécnicas
Universidad Técnica de Manabí, Chone, Ecuador. Correo electrónico: (PA) palcivar4747@
hotmail.com, ; (JM) jpmunoz@outlook.es, ; (CA) andraded@insa-toulouse.fr ; (AD)
alduri81@hotmail.com .
Resumen
La producción y consumo de naranjas genera gran cantidad de residuos
lignocelulósicos que son depositados en los vertederos sin recibir ningún tipo
de tratamiento que le permita ser aprovechados como subproductos. El objetivo
de la presente investigación fue obtener bioalcohol mediante la sacaricación y
fermentación de los residuos lignocelulósicos de la cáscara de la naranja (Citrus
sinensis). Se utilizaron tres (3) niveles de ácido sulfúrico como tratamiento, para
alterar la estructura lignocelulósica de la biomasa, posteriormente, se realizó una
hidrólisis con enzimas celulasas, analizando la presencia de azúcares reductores
por espectrofotometría. La fermentación se efectuó con dos (2) concentraciones
de levaduras Sacharomyces cerevisiae, posteriormente, se destiló y se determinó
la presencia de compuestos orgánicos volátiles por cromatografía de gases. Los
azúcares reductores presentes en mayor proporción fueron glucosa (26,60 ±
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Alcívar-Mendoza et al. ISSN 2477-9407
0,77 g.L
-1
) y fructosa (21,26 ± 0,51 g.L
-1
); el compuesto orgánico volátil de mayor
concentración fue etanol (76,96 %) y el índice de mayor rendimiento de bioalcohol
se obtuvo con el tratamiento de mayor concentración de ácido sulfúrico y levadura
(12,72 ± 0,65 g.L
-1
); las cáscaras de naranja son subproductos de origen vegetal
que pueden ser aprovechadas para la producción de bioalcohol con porcentajes de
etanol superiores al 76%.
Palabras clave Biomasa lignocelulósica, hidrólisis enzimática, subproducto
vegetal.
Abstract
The production and consumption of oranges generates a large amount of
lignocellulosic waste that is deposited in landlls without receiving any type
of treatment that allows it to be used as by-products. The objective of the
present investigation was to obtain bioalcohol through the saccharication
and fermentation of lignocellulosic residues of the peel of the orange (Citrus
sinensis). Three (3) different levels of sulfuric acid were used as treatment, to
alter the lignocellulosic structure of the biomass, subsequently, a hydrolysis with
cellulase enzymes was carried out, analyzing the presence of reducing sugars
by spectrophotometry. The fermentation was carried out with two (2) different
concentration levels of Sacharomyces cerevisiae yeast, subsequently, it was
distilled and the presence of volatile organic compounds was determined by gas
chromatography. The reducing sugars present in the highest proportion were:
glucose (26.6 ± 0.77 g.L
-1
) and fructose (21.26 ± 0.51 g. L
-1
); the volatile organic
compound with the highest concentration was ethanol (76.96%) and the index
with the highest bioalcohol yield was obtained with the treatment with the highest
concentration of sulfuric acid and yeast (12.72 ± 0.65 g. L
-1
); Orange peels are by-
products of vegetable origin that can be used for the production of bioalcohol with
percentages of ethanol higher than 76%.
Keywords: biomass Lignocellulosic, enzymatic hydrolysis, plant by-product.
Resumo
A produção e o consumo da laranja geram uma grande quantidade de resíduos
lignocelulósicos que são depositados em aterros sanitários sem receber nenhum
tipo de tratamento que permita sua utilização como subproduto. O objetivo da
presente investigação foi a obtenção do bioálcool por meio da sacaricação e
fermentação de resíduos lignocelulósicos da casca da laranja (Citrus sinensis).
Três (3) níveis de ácido sulfúrico foram utilizados como tratamento, para alterar
a estrutura lignocelulósica da biomassa, posteriormente, foi realizada uma
hidrólise com enzimas celulase, analisando a presença de açúcares redutores por
espectrofotometria. A fermentação foi realizada com duas (2) concentrações de
levedura Sacharomyces cerevisiae, posteriormente, foi destilada e a presença de
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compostos orgânicos voláteis determinada por cromatograa gasosa. Os açúcares
redutores presentes em maior proporção foram: glicose (26,6 ± 0,77 g.L
-1
) e frutose
(21,26 ± 0,51 g.L
-1
); o composto orgânico volátil com maior concentração foi o
etanol (76,96%) e o índice com maior rendimento de bioálcool foi obtido com o
tratamento com maior concentração de ácido sulfúrico e levedura (12,72 ± 0,65
g.L
-1
); As cascas de laranja são subprodutos de origem vegetal que podem ser
utilizados para a produção de bioálcool com percentuais de etanol superiores a
76%.
Palavras-chave: Biomassa lignocelulósica, hidrólise enzimática, subproduto
vegetal.
Introducción
La producción de naranjas (Citrus
sinensis) a nivel mundial, está
estimada en 47,5 millones de toneladas
métricas por año (USDA, 2021). El
procesamiento y consumo de cítricos
genera cantidades considerables de
residuos debido a que más de la mitad
del fruto son considerados desechos
(cáscaras y semillas) (Pascual, 2019).
Por lo general los residuos tienden a
ser descartados directamente a los
vertederos de desechos sin recibir un
tratamiento adecuado que permita
aprovecharlos de forma ecaz y
eciente (Ordoñez et al., 2018).
Los residuos agrícolas presentan
típicamente una composición rica
en celulosa, hemicelulosa y lignina
(Alata et al., 2019). Esta estructura
resulta idónea para ser aprovechada
como fuente de energías alternativas,
como puede ser la producción de
bioalcohol (Benalcázar et al., 2019).
La producción de bioalcohol de
fuentes vegetales en Europa y Asia se
encuentra en una etapa creciente de
experimentación y producción debido
al gran interes de mitigar el impacto
ambiental ocasionado por este tipo
Introducction
The worldwide oranges production
(Citrus sinensis) is estimated at 47.5
million metric tons per year (USDA,
2021). The processing and consumption
of citrus fruits generates considerable
waste amounts because more than half of
the fruit, are considered waste (peels and
seeds) (Pascual, 2019). In general, waste
tends to be discarded directly to dumps
without receiving adequate treatment
that allows it to be used effectively and
efciently (Ordoñez et al., 2018).
Agricultural residues typically
present a composition rich in cellulose,
hemicellulose and lignin (Alata et al.,
2019). This structure is ideal to be used
for an alternative energy source, such as
the bioalcohol production (Benalcázar
et al., 2019). The bioalcohol production
from vegetal sources in Europe and Asia
is growing up for experimentation and
production, due to the great interest
in mitigating the environmental
impact caused by this type of waste
(Manrique, 2018). However, in Latin
American countries this type of research
is drastically limited by the lack of
technological resources (Manrique,
2018).
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de residuos (Manrique, 2018). Sin
embargo, en paises de América Latina
este tipo de investigaciones estan
drasticamente limitadas por la falta
de recursos tecnologicos (Manrique,
2018).
El proceso de obtención de
bioalcohol de residuos producidos
por la actividad agrícola se realiza
por medio de la transformación de
la biomasa celulósica en azúcares
solubles mediante reacciones químicas
o enzimáticas (Melo et al., 2017),
convirtiendo los hidratos de carbono
fermentables en moléculas de metanol,
etanol y propanol (Cando et al., 2019),
mediante la ruta enzimática de la
glucólisis (degradación de glucosa por
vía aerobia) o por la reacción entre la
glucosa y el piruvato (ruta de Embden-
Meyerhof, o Embden-Meyerhof-
Parnas), (Carranza et al., 2015).
La transformación parcial de
la biomasa (cáscaras de naranjas)
en bioalcohol consiste en aplicar
la respectiva reducción de tamaño
de la materia prima, separación
de aceite esencial del residuo, para
proceder a aplicar un tratamiento
acido - alcalino, y a la incorporación
de enzimas para optimizar la etapa
de sacaricación obteniendo así los
eventuales azúcares reductores que
serán sometidos a un proceso de
fermentación con la incorporación
de levaduras y consecuentemente
la aplicación de una destilación
simple para la obtención potencial de
bioalcohol (Morales, 2015).
La biomasa de la naranja (Citrus
sinensis) tiende a ser colocada
directamente en los vertederos de
basura sin recibir ningún tipo de
To produce bioalcohol from
residues by agricultural activity,
is carried out the transformation
of cellulosic biomass into soluble
sugars through chemical or enzymatic
reactions (Melo et al., 2017),
converting fermentable carbohydrates
into molecules of methanol, ethanol
and propanol (Cando et al., 2019), by
the enzymatic pathway of glycolysis
(glucose degradation aerobically) or
the reaction between glucose and
pyruvate (Embden-Meyerhof, or
Embden-Meyerhof pathway -Parnas),
(Carranza et al., 2015).
The biomass partial transformation
(orange peels) into bioalcohol consists
to realize the respective reduction
in the raw material size, then the
essential oil separation from the
residue to proceed to apply an acid-
alkaline treatment besides the
enzymes incorporation to optimize
the saccharication stage with the
purpose to produce the eventual
reducing sugars that will be subjected
to a fermentation process with yeasts
incorporation and consequently the
application of a simple distillation to
obtain bioalcohol (Morales, 2015).
The oranges biomass (Citrus
sinensis) tends to be placed directly
into garbage dumps without receiving
any type of treatment, and can be
draw on using the saccharication
and fermentation technology of
lignocellulosic residues for bioalcohol
production, helping to small, medium
and large producers, to have an option
to make the most of their production.
The objective of this research was
the bioalcohol production from the
saccharication and fermentation of
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tratamiento, y puede ser aprovechada
mediante la utilización de la tecnología
de sacaricación y fermentación de
residuos lignocelulósicos para la
producción de bioalcohol, ayudando
a los pequeños, medianos y grandes
productores, a disponer de una
opción para aprovechar al máximo
su producción. El objetivo de la
presente investigación fue obtener
bioalcohol a partir de la sacaricación
y fermentación de la biomasa
lignocelulósica de la cáscara de la
naranja (Citrus sinensis).
Materiales y métodos
Material vegetal
Las naranjas (Citrus sinensis) de
tipo descarte comprendidas entre
cuatro (4) y seis (6) cm de diámetro,
con apariencia rme, color y olor
característico utilizadas en el presente
estudio se recolectaron en el centro de
acopio Zambrano ubicado en el cantón
Flavio Alfaro y el procedimiento
experimental se realizó en los
laboratorios de la Universidad Técnica
de Manabí.
Obtención de los residuos
lignocelulósicos
Una vez recibidas las naranjas se
retiró la corteza de forma manual, se
procedió a lavarlas con agua potable
y se cortaron en forma de cuadros
de aproximadamente 0,2-0,5 cm,
posteriormente, se colocaron 325 g de
las cortezas, en un balón de destilación,
se adicionó 575 mL de agua destilada
y se realizó la extracción de aceites
esenciales, utilizando una manta
de calentamiento y un equipo de
hidrodestilación con una trampa de
oranges peel lignocellulosic biomass
(Citrus sinensis).
Materials and methods
Vegetal material
In this study, Discard-type
oranges (Citrus sinensis) with a
diameter between four (4) and six
(6) cm, rm appearance besides a
characteristic color and smell were
used. The oranges were picked up
at the Zambrano collection center
located in the Flavio Alfaro canton
and the experimental procedure was
carried out in the Universidad Técnica
Manabí laboratories.
Obtaining lignocellulosic
residues
Once the oranges were received,
the rind was removed manually.
They were washed with drinking
water and were cut into squares
of approximately 0.2-0.5 cm.
Subsequently, 325 g of the rinds were
placed into a distillation balloon; Then
575 mL of distilled water was added
and the essential oils extraction was
realized using a heating blanket and
a hydrodistillation equipment with a
Clevenger trap at a temperature of 90
°C during 170 minutes to eliminate
compounds that could interfere with
fermentation, the process was carried
out three times.
After the hydrodistillation, the
crusts were removed from the balloon
and placed into an oven (Biobase
Brand, BJPX-JUNEAU model) at a
temperature of 105 °C for 24 hours
in order to eliminate a water content
part to obtain a relative humidity of
12%. Then, they were ground in a
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Clevenger a una temperatura de 90°C
por un tiempo de 170 minutos, con la
nalidad de eliminar compuestos que
pudieran interferir en la fermentación,
el proceso se realizó por triplicado.
Una vez realizada la
hidrodestilación, las cortezas se
retiraron del balón y se colocaron en
una estufa (Marca Biobase, modelo
BJPX-JUNEAU) a una temperatura
de 105 °C por lapso de tiempo de 24
horas, con la nalidad de eliminar
parte del contenido de agua y obtener
una humedad relativa de 12 %.
Posteriormente, se molieron en un
molino (Marca Pulverisette 11) con
un disco de abertura de 4,5 mm y una
velocidad de rotación de 1700 rpm y se
tamizaron en un equipo (Marca AISI
304) con una luz de malla de 0,420 mm
(diámetro de 210 mm), hasta obtener
un sólido pulverulento.
Análisis sicoquímico de los
residuos lignocelulósicos
El análisis sicoquímico de los
residuos lignocelulósicos de la cáscara
de naranja se realizó de acuerdo al
Método Ocial (AOAC, 2002). Para
efectos de este trabajo se determinó,
humedad, pH y bra no soluble.
Tratamiento ácido alcalino e
hidrolisis enzimática
Se pesaron por triplicado 50 g de
los residuos lignocelulósicos de la
cáscara de naranja y se colocaron en
los reactores discontinuos (Matraces
Erlenmeyer de 1000 mL), en dos
etapas simultáneas, respectivamente,
tratamiento ácido (T1) y tratamiento
alcalino (T2). El (T1) consistió en
incorporar en los reactores ácido
sulfúrico en tres concentraciones (2%,
4% y 6%, respectivamente), se adicionó
mill (Pulverisette 11 Brand) with a
4.5 mm aperture disc with a rotation
speed of 1700 rpm and were sieved in
an equipment (Brand AISI 304) with
a mesh size of 0.420 mm (diameter of
210 mm), until obtained a powdery
solid.
Physicochemical analysis of
lignocellulosic residues
Was carried out according to the
Ofcial Method (AOAC, 2002). For the
purposes of this research, the following
parameters were determined:
humidity, pH and insoluble ber.
Acid-alkaline treatment and
enzymatic hydrolysis
Initially, 50 g of the orange peel
residues were weighed at three times
and placed into the discontinuous
reactors (Erlenmeyer asks of 1000
mL), in two simultaneous stages,
respectively, acid treatment (T1) and
alkaline treatment (T2). The (T1)
was carried out with sulfuric acid in
three concentrations (2%, 4% and
6%, respectively) that were set into
the reactors, then distilled water
was added in a solid / liquid ratio 1:5
(m/v) and proceeded to heat to 150
°C for 30 min under an atmospheric
pressure. For (T2) 0.74 g of calcium
hydroxide were added for each gram
of lignocellulosic residue in the three
reactors. Then, the reactors were
leveled to a volume of 720 mL with
distilled water. The residues were
placed in a 1000 mL beaker, covered
with aluminum foil and placed in an
oven at a temperature of 90 °C for 26
hours. Once cooled, they were washed
several times with distilled water
until a clear ltrate was obtained.
The washed residues were placed
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agua destilada en una relación lido/
líquido 1:5 (m/v) y se procedió a
calentar a 150 °C por 30 min a una
atmósfera de presión. El (T2) consistió
en adicionar en los tres reactores
0,74 g de hidróxido de calcio por cada
gramo de residuo lignocelulósico y
se enrazó a un volumen 720 mL con
agua destilada. Los residuos fueron
colocados en un vaso de precipitado
de 1000 mL, tapados con papel de
aluminio y colocados en una estufa
a una temperatura de 90°C por 26
horas. Una vez enfriado, se lavaron
por sucesivas ocasiones con agua
destilada hasta obtener un ltrado
claro. Los residuos lavados se
colocaron en vasos de precipitado y se
neutralizaron con ácido cítrico al 20
% m/v, para nuevamente lavarlos con
agua destilada, con el n de eliminar
los excedentes de hidróxido de calcio
presente en la biomasa y proceder a
ajustar el pH a 5,3.
Mediante el protocolo descrito, la
biomasa se colocó en el reactor, en el cual
se adicionaron las enzimas celulasas
12 UI.g
-1
de residuos lignocelulósicos
y se incubaron a una temperatura de
50°C por 48 horas, posteriormente, se
ltraron con papel Whatman de grado
1 (11 µm) obteniéndose un líquido de
color pardo que contenía los azúcares
fermentables.
Determinación de azúcares
reductores
Para determinar el índice
de sacaricación de los residuos
lignocelulósicos se realizó la
determinación de azúcares reductores,
empleando el método colorimétrico
con ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS),
para lo cual se tomó una muestra
in beakers and neutralized with
citric acid at 20% m/v, to be washed
again with distilled water in order
to eliminate the excess of calcium
hydroxide present in the biomass and
proceed to adjust the pH to 5.3.
Trought the described process,
the biomass was placed into the
reactor, in which cellulose enzymes
12 IU.g
-1
of lignocellulosic residues
were added and incubated at a
temperature of 50 °C for 48 hours.
Subsequently, they were ltered
with paper Whatman grade 1 (11
µm), obtaining a brown liquid with
fermentable sugars.
Determination of reducing
sugars
To determine the saccharication
index of lignocellulosic residues, the
determination of reducing sugars was
carried out, using the colorimetric
method with 3,5 dinitrosalicylic acid
(DNS), for which a sample of four (4)
mL was taken and placed in a test
tube with 40 mL of distilled water,
then was centrifuged at 10,000 rpm
for 10 minutes. Once centrifuged, 0.5
mL of the dilution and 0.5 mL of the
DNS reagent were added in a test
tube, and placed in a bain Marie at
100 °C for a period of ve (5) minutes.
After It cooled, to room temperature,
ve (5) mL of distilled water was
added. The absorbance measurement
was realized on a SPECTRONIC
200 spectrophotometer (Thermo
Scientic) at a wavelength of 540 nm.
For quantication, a reducing sugars
calibration curve was prepared
using glucose (200-1000 mg.L
-1
) as
standard, and distilled water was
used as a blank.
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de cuatro (4) mL y se colocó en un
tubo de ensayo con 40 mL de agua
destilada, seguidamente, se centrifugó
a 10000 rpm por 10 minutos. Una
vez centrifugada, se adicionó 0,5 mL
de la dilución y 0,5 mL del reactivo
DNS en un tubo de ensayo y se
colocó en un baño maría a 100 °C
por un lapso de tiempo de cinco (5)
minutos, se enfrió hasta temperatura
ambiente y se le adicionó cinco (5)
mL de agua destilada. La medición
de la absorbancia se realizó en un
espectrofotómetro SPECTRONIC 200
(Thermo Scientic) a una longitud de
onda de 540 nm. Para la cuanticación
se preparó una curva de calibración de
azúcares reductores empleando como
estándar glucosa (200-1000 mg.L
-1
), y
se utilizó agua destilada como blanco.
Fermentación alcohólica y
destilación
El proceso de fermentación
alcohólica se realizó en biorreactores
adaptados a escala de laboratorio a una
temperatura de 30°C durante nueve
(9) días. Para ello, el líquido pardo
obtenido de la hidrólisis de los tres
biorreactores de aproximadamente
seis (6) °Brix, se pasteurizó a 90 °C por
10 minutos para lograr inactivar las
enzimas, luego se procedió a separar
cada uno de los contenidos de los
reactores en dos partes iguales para
proceder a incorporar en cada reactor
previamente adecuado 3 % y 6 % de
levadura (Sacharomyces cerevisiae)
y nutrientes (urea 0,48 g.L
-1
y fosfato
ácido de potasio 0,24 g.L
-1
), de acuerdo
al procedimiento descrito por Paredes
(2016). Al nalizar el proceso de
fermentación se procedió a realizar la
respectiva destilación utilizando un
Alcoholic fermentation and
distillation
Was carried out in bioreactors
adapted to a laboratory scale at a
temperature of 30 °C for nine (9) days.
The brown liquid obtained from the
hydrolysis of the three bioreactors
with approximately six (6) °Brix,
was pasteurized at 90 °C for 10
minutes to inactivate the enzymes.
Then it proceeded to separate each
of the reactors contents in two equal
parts, to incorporate in each reactor,
previously adequate with 3% and 6%
of yeast (Sacharomyces cerevisiae)
and nutrients (urea 0.48 gL
-1
and
potassium acid phosphate 0.24
g.L
-1
), according to the procedure
described by Paredes (2016). At the
end of the fermentation process, the
respective distillation was realized
using a laboratory distillation
equipment to produce the bioalcohol.
Volatile organic compounds
determination
The volatile organic compounds
determination and the levels of
ethanol, methanol, ethyl ether,
and acetic acid was performed by
gas chromatography using a gas
chromatograph (Shimadzu brand,
GC-2014 model) under controlled
conditions of injection temperature
on isocratic conditions at 250 °C
for 60 min. The sample injection
volume was 2 µL on an RTX 1701
column (30 m x 0.25 µm x 0.32
mm ID) and helium was used as a
stripping gas. The quantication
was carried out with the external
standard method, using pure
standards of ethanol, methanol and
higher alcohols.
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equipo de destilación de laboratorio
obteniendo así el bioalcohol.
Determinación de compuestos
orgánicos volátiles
La determinación directa de
compuestos orgánicos volátiles y niveles
de etanol, metanol, éter etílico y ácido
acético; se realizó por cromatografía
de gases empleando un cromatógrafo
de gases (Marca Shimadzu, modelo
GC-2014) en condiciones controladas
de: temperatura de inyección en
condiciones isocráticas a 250 °C por un
lapso de tiempo de 60 min. El volumen
de inyección de muestra fue de 2 µL en
una columna RTX 1701 (30 m x 0,25
µm x 0,32 mm ID) y se usó helio como
gas de arrastre. La cuanticación
se realizó con el método de estándar
externo, utilizando estándares
puros de etanol, metanol y alcoholes
superiores.
El contenido de bioalcohol
expresado en grados Gaylusac se
determinó mediante la utilización
de un alcoholímetro digital (Marca
Alcoscan Profesional, modelo Al 6000
Fda). Se determinó el rendimiento
mediante un balance de masa
considerando la cantidad de cáscaras
de naranjas y la cantidad de bioalcohol
obtenido.
Diseño experimental y análisis
estadístico
Para el desarrollo experimental
se utilizó un diseño factorial A*B con
tres repeticiones por cada uno de los
tratamientos. Los factores fueron las
tres concentraciones de ácido sulfúrico
(2 %, 4 % y 6 %) y dos niveles de
levaduras (3 % y 6 %) por cada 100
g de cáscaras de naranja. Los datos
se analizaron mediante el paquete
The