681
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38(3): 681-691. Julio-Septiembre.
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v38.n3.12 ISSN 2477-9407
Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido el 25-08-2020 . Aceptado el 25-07-2020
*Autor de correspondencia. Correo electrónico:
pinto_ruiz@yahoo.com.mx
Nota técnica / Technical note
Efecto del método de extracción de líquido ruminal
en la técnica de gas in vitro
Effect of the ruminal liquid extraction method in the in vitro
gas technique
Efeito do método de extração de líquido ruminal na técnica
de gases in vitro
Roselia Ramírez Díaz
1
, René Pinto Ruiz
2
*, Francisco Guevara
Hernández
2
, José Apolonio Venegas Venegas
2
, Mariela Beatriz
Reyes Sosa
1,2
y Luis Alberto Miranda Romero
2
1
Estudiante de Doctorado en Ciencias Agropecuarias y Sustentabilidad, Universidad
Autónoma de Chiapas. Correo electrónico: (RR) ramirez.rrd@gmail.com, .
2
Universidad
Autónoma de Chiapas, Facultad de Ciencias Agronómicas, carretera Ocozocoautla-Villaores
km 84.5, Villaores, Chiapas, México, C. P. 30470. Correo electrónico: (RP) pinto_ruiz@yahoo.
com.mx, ; (FG) francisco.guevara@unach.mx, ; (JV) polo_tex1@hotmail.com, ; (MR)
mareso84@gmail.com, ; (LM) debraj.aryal@hotmail.com, . .
Resumen
Los estudios de gas in vitro requieren del uso de animales canulados; sin embargo,
el alto costo de la cirugía limita su aplicación. Por lo que, el objetivo del estudio fue
evaluar el efecto de la técnica de extracción de líquido ruminal por sonda oro-ruminal
sobre los resultados derivados de la técnica de producción de gas in vitro (TPG). La
harina de Elaeis guineensis se utilizó como sustrato. El líquido ruminal se obtuvo de
dos formas: de animales canulados y sonda oro-ruminal. Se estimó la degradación
de la materia seca (DGRMS), parámetros de la cinética de fermentación y volumen
fraccional por la TPG. La comparación de medias se realizó utilizando el procedimiento
de Tukey (p<0,05). Los resultados indicaron la falta de diferencias estadísticas
signicativas (p>0,05). Se concluyó que, la técnica de extracción de líquido ruminal,
no modicó la DGRMS, los parámetros y fracciones de fermentación de E. guineensis.
Palabras clave: in vitro, ovinos, degradación, fermentación.
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Ramírez et al. ISSN 2477-9407
Abstract
In vitro gas studies require the use of cannulated animals; however, the high
cost of the surgery limits its application. Therefore, the objective of the study was
to evaluate the effect of the ruminal uid extraction technique by oro-ruminal
probe affects the results derived from the in vitro gas production technique (GPT).
Elaeis guineensis meal was used as a substrate. Ruminal uid was obtained in
two ways: cannulated animals and oro-ruminal probe. Dry matter degradation
was estimated (DMD), parameters of fermentation kinetics and fractional volume
by the GPT. The comparison of means was carried out using the Tukey procedure
(p<0.05). The results indicated the lack of signicant statistical differences
(p>0.05). It was concluded that the ruminal uid extraction technique did not
modify the DGRMS, the parameters and fermentation fractions of E. guineensis.
Key words: in vitro, sheep, degradation, fermentation.
Resumo
Os estudos de gases in vitro requerem o uso de animais canulados; entretanto,
o alto custo da cirurgia limita sua aplicação. Portanto, o objetivo do estudo foi
avaliar o efeito da técnica de extração de uido ruminal por sonda ororruminal
sobre os resultados derivados da técnica de produção de gás in vitro (TPG). Farinha
de Elaeis guineensis foi usada como substrato. O líquido ruminal foi obtido de duas
formas: de animais canulados e sonda ororruminal. A degradação da matéria seca
(DGRMS), os parâmetros cinéticos da fermentação e o volume fracionário foram
estimados por TPG. A comparação das médias foi realizada pelo procedimento
de Tukey (p<0,05). Os resultados indicaram a ausência de diferenças estatísticas
signicativas (p>0,05). Concluiu-se que a técnica de extração do uido ruminal não
modicou o DGRMS, os parâmetros e as frações de fermentação de E. guineensis.
Palavras-chave: in vitro, ovelha, degradação, fermentação.
Introducción
La técnica de producción de gas
in vitro es ampliamente usada para
determinar cinética de fermentación
de alimentos a través del volumen
de gas liberado, producto de la
fermentación (Posada y Noguera,
2005), también permite conocer las
fracciones de fermentación y estimar
energía metabolizable, energía
Introduction
The in vitro gas production
technique is widely used to determine
the kinetics of food fermentation
through the volume of gas released,
a product of fermentation (Posada
and Noguera, 2005), it also allows to
know the fermentation fractions and
estimate metabolizable energy, net
energy, digestibility of organic matter,
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neta, digestibilidad de la materia
orgánica, biomasa microbiana y gases
efecto invernadero por fermentación
entérica (Jiménez-Santiago et al.,
2019, Ramírez et al., 2020). No
obstante, para realizar este tipo de
investigaciones, es necesario contar
con animales canulados para obtener
inóculo a partir del líquido ruminal
(Vargas-Bayona et al., 2013), lo que
limita su implementación en diversos
laboratorios, debido a los altos costos
de la cirugía, el manejo sanitario de
los animales (Martín et al., 2005) y,
en algunos casos, la mortalidad post
cirugía, debido a la susceptibilidad
de los animales a enfermedades.
Por tal razón se han utilizado otras
técnicas para obtener líquido ruminal
(LR), como es el uso de la sonda
oro-ruminal, la cual es económica,
práctica y menos invasiva (Shen et
al., 2012). Esta técnica se utilizó con
éxito para hacer transfaunaciones
de animales saludables a otros con
desórdenes digestivos y enfermedades
metabólicas (Pereira et al., 2018).
Si bien, el uso de animales
canulados para la extracción de LR
es considerada una forma convincente
con relación a los resultados de los
estudios que arroja, también deben
considerarse las ventajas del uso de
sondas oro-ruminales. Sin embargo,
no existe información que indique la
eciencia del método de extracción
de líquido ruminal por sonda oro-
ruminal en los resultados derivados
de la técnica de gas in vitro, pero
se demostró su ecacia al obtener
muestras ruminales para conocer el
desarrollo de poblaciones microbianas
del rumen, determinación de ácidos
microbial biomass and greenhouse
gases due to enteric fermentation
(Jiménez-Santiago et al., 2019;
Ramírez et al., 2020). However, to
carry out this type of research, it is
necessary to have cannulated animals
to obtain inoculum from ruminal uid
(Vargas-Bayona et al., 2013), which
limits its implementation in various
laboratories, due to the high costs of
surgery, animal health management
(Martín et al., 2005) and, in some
cases, post-surgery mortality due to
the animals’ susceptibility to diseases.
For this reason, other techniques have
been used to obtain ruminal uid (RL),
such as the use of the oro-ruminal
probe, which is economical, practical
and less invasive (Shen et al., 2012).
This technique was used successfully
to transfaun healthy animals to others
with digestive disorders and metabolic
diseases (Pereira et al., 2018).
Although the use of cannulated
animals for the extraction of LR
is considered a convincing way in
relation to the results of the studies
it produces, the advantages of the
use of oro-ruminal probes should
also be considered. However, there
is no information that indicates
the efciency of the ruminal uid
extraction method by oro-ruminal
probe in the results derived from
the in vitro gas technique, but its
effectiveness was demonstrated when
obtaining ruminal samples to know the
development of microbial populations
of the rumen, determination of
volatile fatty acids, minerals and pH
(Ramos-Morales et al., 2014, Lourenco
et al., 2019). Therefore, the objective
of the present study was to evaluate
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grasos volátiles, minerales y pH
(Ramos-Morales et al., 2014, Lourenco
et al., 2019). Por lo anterior, el objetivo
del presente estudio fue evaluar y
comparar los resultados obtenidos en
la técnica de gas in vitro al utilizar
líquido ruminal obtenido por cánula o
sonda oro-ruminal.
Materiales y métodos
La investigación se realizó en el
Laboratorio de Nutrición Animal de
la Facultad de Ciencias Agronómicas
de la Universidad Autónoma Chiapas,
ubicado en el municipio de Villaores,
Chiapas. La región presenta una
precipitación media anual de 1.100
mm y una temperatura media anual de
25 °C. Se utilizó como sustrato harina
de palmiste (Elaeis guineensis) y fue
analizada para determinar materia
seca (MS), proteína cruda (PC) según
AOAC (2000), bra detergente neutro
(FDN) y bra detergente ácida (FDA)
de acuerdo con la técnica descrita por
Van Soest et al. (1991).
El líquido ruminal (LR) fue extraído
de tres ovinos machos canulados (CR)
y de tres ovinos por sonda oro-ruminal
(SR), todos de la raza Katahdin de
42 ± 1,5 kg y de aproximadamente
un año de edad. Los animales se
alimentaron con una dieta isoproteíca
e isoenergética compuesta de 60 %
de pasto Cynodon nlemfuensis, 26 %
maíz y 14 % harina de palmiste, la
cual fue formulada para satisfacer
sus necesidades nutricionales de
acuerdo a NRC (National Research
Council) (NRC, 2007) y en todo
momento tuvieron un trato de acuerdo
con los protocolos de la Ley Federal
and compare the results obtained in
the in vitro gas technique when using
ruminal uid obtained by cannula or
oro-ruminal probe.
Materials and methods
The research was carried out in the
Laboratorio de Nutrición Animal de la
Facultad de Ciencias Agronómicas of
the Universidad Autónoma Chiapas,
located in the municipality of
Villaores, Chiapas. The region has an
average annual rainfall of 1,100 mm
and an average annual temperature
of 25 °C. Palm kernel cake (Elaeis
guineensis) was used as substrate
and it was analyzed to determine
dry matter (DM), crude protein (PC)
according to AOAC (2000), neutral
detergent ber (NDF) and acid
detergent ber (FDA) according to the
technique described by Van Soest et
al. (1991).
The ruminal uid (LR) was
extracted from three cannulated
male sheep (CR) and from three
sheep by oro-ruminal probe (SR), all
of the Katahdin breed, 42 ± 1.5 kg
and approximately one year old. The
animals were fed an isoprotein and
isoenergetic diet composed of 60 %
Cynodon nlemfuensis grass, 26 % corn
and 14 % palm kernel cake, which was
formulated to meet their nutritional
needs according to NRC (National
Research Council) (NRC, 2007) and
at all times they were treated in
accordance with the protocols of the
Federal Animal Health Law in force,
NOM-062-ZOO-1999 and under the
animal welfare standards established
in Facultad de Ciencias Agronómicas
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de Sanidad Animal vigente, NOM-
062-ZOO-1999 y bajo las normas de
bienestar animal establecidas en la
Facultad de Ciencias Agronómicas de
la Universidad Autónoma de Chiapas.
Antes de la extracción de LR, los ovinos
tuvieron un periodo de ayuno de 12 h,
ello con la nalidad de conseguir un
uido ruminal mas consistente en
composición y actividad (Williams,
2000 y Posada y Noguera, 2005).
Para la extracción de LR por SR
se utilizó una manguera de 1,25 m
de longitud con un diámetro externo
de 1” y 3 mm de espesor de pared,
con perforaciones en el extremo que
fue introducido en el saco ruminal,
el extremo opuesto se conectó a un
matraz kitasato para colectar el LR y
el cual a su vez fue conectado a una
bomba de succión. Para introducir la
sonda, se utilizó un abrebocas metálico
cubierto con una banda de caucho
para evitar lesiones. Se extrajo 100
mL de LR/ animal/muestreo, el exceso
de saliva se retiró previo a usar el LR.
La cinética de fermentación,
fracciones y degradación de la materia
seca in vitro se determinó mediante
el procedimiento descrito por Menke
y Steigass (1988), para lo cual se
usaron frascos color ámbar de 125 mL
de capacidad a los que se les colocó
0,5 g de MS de harina de palmiste.
Se preparó una solución mineral
reducida
compuesta de K
2
HPO
4
(0,45 g.L
-1
), KH
2
PO
4
(0,45 g.L
-1
),
NaCO
3
(0,6 g.L
-1
), (NH4)
2
SO
4
(0,45
g.L
-1
), NaCl (0,9 g.L
-1
), MnSO
4
(0,18
g.L
-1
), CaCl
2
(0,12 g.L
-1
), L-cisteína
(0,25 g.L
-1
) y Na
2
S (0,25 g.L
-1
)
y se
usaron dos fuentes de líquido ruminal,
correspondiente a cada método de
de la Universidad Autónoma de
Chiapas. Before the LR extraction, the
sheep had a fasting period of 12 h, this
in order to achieve a more consistent
ruminal uid in composition and
activity (Williams, 2000 and Posada
and Noguera, 2005).
For the LR extraction by SR, a
1.25 m long hose with an external
diameter of 1” and 3 mm wall
thickness was used, with perforations
at the end that was introduced into
the ruminal sac, the opposite end was
it was connected to a kitasato ask to
collect the LR and which in turn was
connected to a suction pump. To insert
the probe, a metal gag covered with
a rubber band was used to prevent
injury. One hundred (100) mL of LR/
animal/sample was extracted, excess
saliva was removed prior to using the
LR.
The in vitro kinetics of
fermentation, fractions and
degradation of dry matter were
determined by the procedure
described
by Menke and Steigass (1988), for which
amber bottles of 125 mL capacity were
used, to which 0.5 g of DM of palm kernel
cake was placed. A reduced mineral
solution composed of K
2
HPO
4
(0.45 g.L
-1
),
KH
2
PO
4
(0.45 g.L
-1
), NaCO
3
(0.6 g.L
-1
),
(NH
4
)
2
SO
4
(0.45 g.L
-1
) was prepared,
NaCl (0.9 g.L
-1
), MnSO
4
(0.18 g.L
-1
),
CaCl
2
(0.12 g.L
-1
), L-cysteine (0.25 g.L
-1
)
and Na
2
S (0.25 g.L
-1
) and two sources of
ruminal liquid were used, corresponding
to each extraction method (cannula
and oro-ruminal probe), subsequently
and under a continuous ow of carbon
dioxide (CO
2
), 90 mL of inoculum were
added to each ask diluted ruminal
(1:10) according to treatment.
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extracción (cánula y sonda oro-
ruminal), posteriormente y bajo un
ujo continuo de bióxido de carbono
(CO
2
), a cada frasco se le agregaron 90
mL de inóculo ruminal diluido (1:10)
de acuerdo al tratamiento.
La presión del gas producido se
midió con un manómetro marca Infra
modelo 63100/1-4 (0 a 1 kg.cm
-2
) a
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24,
28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 60, 66 y 72
horas de incubación. Los valores de
presión (kg.cm
-2
) se transformaron
a volumen de gas (mL.g
-1
materia
seca) con la ecuación de regresión
(volumen= presión/0,019 con R
2
=0,98),
y se estimaron los parámetros de
la cinética de producción de gas:
volumen máximo (Vmáx; mL.g
-1
), tasa
(S; h) y fase de retardo (L; h), para el
modelo logístico V = Vmáx/1+e
(2-4*S (T-L))
(Schoeld y Pell, 1995), utilizando el
Sistema de Análisis Estadístico SAS
(SAS, 2011). La degradación in vitro de
la materia seca (DGRMS) se determinó
a 72 h. Se calculó por diferencia entre
el peso de la materia seca inicial,
antes de ser incubada, y el peso de la
materia seca residual después de 72 h
de incubación. Al nal del periodo de
incubación, el contenido de cada frasco
se ltró a través de papel de ltrado
previamente pesado. Los papeles con
residuo se secaron a 65 °C por 48 h,
se pesaron y se restó el peso del papel
ltro. Las fracciones de fermentación
se obtuvieron mediante el volumen
fraccional (Vf) de gas de fermentación
producido a tres intervalos de tiempo:
0 h a 8 h (Vf
0-8
), 8 h a 24 h (Vf
8-24
) y
24 h a 72 h (Vf
24-72
) de incubación,
que corresponden a carbohidratos
solubles, carbohidratos de reserva
The pressure of the gas produced
was measured with an Infra model
63100 / 1-4 (0 to 1 kg.cm
-2
) manometer
at 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24,
28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 60, 66 and
72 hours of incubation. The pressure
values (kg.cm
-2
) were transformed
into gas volume (mL.g
-1
dry matter)
with the regression equation (volume
= pressure/0.019 with R
2
= 0.98), and
the parameters of gas production
kinetics were estimated: maximum
volume (Vmax; mL.g
-1
), rate (S; h) and
lag phase (L; h), for the logistic model
V = Vmax/1 + e
(2-4 * S (TL))
(Schoeld and
Pell, 1995), using the SAS Statistical
Analysis System (SAS, 2011). In vitro
degradation of dry matter (DGRMS)
was determined at 72 h. It was
calculated by the difference between
the weight of the initial dry matter,
before being incubated, and the
weight of the residual dry matter after
72 h of incubation. At the end of the
incubation period, the contents of each
vial were ltered through pre-weighed
lter paper. The papers with residue
were dried at 65 °C for 48 h, weighed
and the weight of the lter paper
was substracted. The fermentation
fractions were obtained by the
fractional volume (Vf) of fermentation
gas produced at three time intervals: 0
h to 8 h (Vf
0-8
), 8 h to 24 h (Vf
8-24
) and 24
h to 72 h (Vf
24-72
) of incubation, which
correspond to soluble carbohydrates,
reserve carbohydrates and structural
carbohydrates, respectively (Sandoval
et al., 2016). These fractional volumes
(mL.g
-1
) were transformed into
fractions (g.kg
-1
) of fast (FR), medium
(FM) and slow (FL) fermentation by
means of the following regression
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y carbohidratos estructurales,
respectivamente (Sandoval et al.,
2016). Estos volúmenes fraccionales
(mL.g
-1
) fueron transformados a
fracciones (g.kg
-1
) de rápida (FR),
media (FM) y lenta (FL) fermentación
mediante las siguientes ecuaciones de
regresión (Miranda et al., 2015): FR
(g.kg
-1
) = Vf
0-8
/0,4266 (R
2
= 0,944 1),
FM (g.kg
-1
) = Vf
8-24
/ 0,6152 (R
2
= 0,998),
FL (g.kg
-1
) = Vf
24-72
/0,3453 (R
2
= 0,965
3).
Se evaluaron dos tratamientos con
nueve repeticiones en cada uno, las
cuales fueron obtenidas de los valores
medios, productos de la repetición
por tres veces consecutivas del
experimento, según recomienda Udén
et al. (2012).
Se utilizó un diseño completamente
al azar con dos tratamientos y nueve
repeticiones. Los datos obtenidos de
las variables estudiadas se analizaron
mediante PROC GLM (SAS, 2011)
y las medias de tratamientos se
compararon con la prueba de Tukey
(p<0,05).
Resultados y discusión
El contenido de MS de la harina
de palmiste fue de 91,9 %, con
14,47 % de PC, 69,7 % de FDN y
45,56 % de FDA. Los parámetros
de la cinética de fermentación y las
fracciones (rápida, media y lenta)
de harina de Elaeis guineensis
inoculada con LR obtenido por CR
y por SR no presentaron diferencias
estadísticas (p>0,05; Cuadro 1). La
tasa de fermentación promedio fue
de 0,0275 h
-1
, con una L de 6,575
h, mientras que el Vmáx promedio
equations (Miranda et al., 2015): FR
(g.kg
-1
) = Vf
0-8
/0.4266 (R
2
= 0.944 1),
FM (g.kg
-1
) = Vf
8-24
/0.6152 (R
2
= 0.998),
FL (g .kg
-1
) = Vf
24-72
/0.3453 (R
2
= 0.965
3).
Two treatments were evaluated
with nine repetitions in each one,
which were obtained from the mean
values, products of the repetition
for three consecutive times of the
experiment, as recommended by Udén
et al. (2012).
A completely randomized design
with two treatments and nine
repetitions was used. The data
obtained from the variables studied
were analyzed using PROC GLM
(SAS, 2011) and the treatment means
were compared with the Tukey test (p
<0.05).
Results and discussion
The DM content of the palm kernel
cake was 91.9 %, with 14.47 % of CP,
69.7 % of NDF and 45.56 % of FDA.
The parameters of the fermentation
kinetics and the fractions (fast,
medium and slow) of Elaeis guineensis
meal inoculated with LR obtained by
CR and SR did not present statistical
differences (p> 0.05; Table 1). The
average fermentation rate was 0.0275
h
-1
, with an L of 6.575 h, while the
average Vmax was 316.81 mL.g
-1
. For
its part, the DGRMS of E. guineensis
meal at 72 h of incubation showed a
similar behavior in both extraction
methods (p> 0.05).
The lack of differences between the
two LR extraction techniques on the
variables evaluated is probably due
to the fact that the LR obtained by SR
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Ramírez et al. ISSN 2477-9407
fue de 316,81 mL.g
-1
. Por su parte,
la DGRMS de la harina de E.
guineensis a las 72 h de incubación
mostró un comportamiento similar
en ambos métodos de extracción
(p>0,05).
La falta de diferencias entre
ambas técnicas de extracción de
LR sobre las variables evaluadas,
probablemente se deba a que el LR
obtenido por SR, no se contaminó con
saliva y fue representativo. Lo que
concuerda con Martín et al. (2005),
quienes cuanticaron las poblaciones
de bacterias y hongos ruminales
en muestras de contenido ruminal
obtenidos por CR y SR en bovinos y
señalaron que, mientras el LR no se
contamine por saliva los resultados
serán similares ente sí. Por su parte,
Shen et al. (2012) y Ramos-Morales et
al. (2014), no encontraron diferencias
en la estimación de ácidos grasos
volátiles, amoniaco, lactato, potasio,
cloruro, calcio y fósforo y pH, cuando
usaron SR y animales canulados, por
lo que concluyeron que el uso de SR
podría ser una alternativa para tomar
muestras ruminales. Por otro lado,
Terré et al. (2013), no encontraron
diferencias en la cuanticación
de bacterias gramnegativas y
grampositivas al extraer LR por CR
y SR, sin embargo, si se presentaron
diferencias en la cuanticación de pH
y AGV, concluyendo que, a pesar de las
diferencias encontradas los resultados
obtenidos con las dos técnicas están
altamente correlacionadas, por lo
que, se puede utilizar un factor de
corrección para aproximar ambos
métodos y permitir comparaciones
entre estudios.
was not contaminated with saliva and
was representative. What agrees with
Martín et al. (2005), who quantied the
populations of ruminal bacteria and
fungi in samples of ruminal content
obtained by CR and SR in bovines and
pointed out that, as long as the LR is not
contaminated by saliva, the results will
be similar to each other. For their part,
Shen et al. (2012) and Ramos-Morales
et al. (2014), found no differences in
the estimation of volatile fatty acids,
ammonia, lactate, potassium, chloride,
calcium and phosphorus and pH, when
they used SR and cannulated animals,
for which they concluded that the
use of SR could be an alternative to
take ruminal samples. On the other
hand, Terré et al. (2013), did not nd
differences in the quantication of
gram-negative and gram-positive
bacteria when extracting LR by CR and
SR, however, there were differences
in the quantication of pH and AGV,