261
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2021, 38: 261-278. Abril-Junio.
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v38.n2.03 ISSN 2477-9407
Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido el 23-03-2020 . Aceptado el 04-07-2020.
*Correspondig autor. Email: acebrahimzadeh@gmail.com, ebrahimzadeh@maragheh.ac.ir
Micropropagation of Pelargonium odoratissimum (L.)
L’Her. through petioles and leaves
Micropropagación de Pelargonium odoratissimum (L.)
L’Her., a través de explantes de hojas y pecíolos
Micropropagação de Pelargonium odoratissimum (L.)
L’Her. através de pecíolos e folhas
Asghar Ebrahimzadeh
1,*
, Maliheh Fathollahzadeh
2
,
Mohammad Bagher Hassanpouraghdam
3, 4
and Mohammad
Ali Aazami Mavaloo
5
1
Assitant Professor, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture,
University of Maragheh, Iran. Email:acebrahimzadeh@gmail.com, .
2
Former Master
student, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of
Maragheh, Iran. Email: f_malihe@yahoo.com.
3
Associate Professor, Department of
Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Maragheh, Iran. Email:
hassanpouraghdam@gmail.com, .
4
Islamic Parliament Research Center, Tehran,
Iran.
5
Assitant Professor, Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture,
University of Maragheh, Iran. Email: aazami58@gmail.com, .
Abstract
Pelargonium odoratissimum (L.) L’Her is a hard rooting plant and the
common methods of propagation via stem cuttings are not successful with this
species. therefore, tissue culture methods have been experienced for the mass-
propagation of this high-valued species. Intact leaves, leaf segments and petiole
sections derived from nodal explants in vitro were employed for the optimization
of P. odoratissimum micropropagation. The treatment combinations used were
MS and
1
/
2
MS media supplemented with 6-benzylaminopurine, BAP (1, 1.5, 2
and 4.5 mg.L
-1
) and 1-naphthaleneacetic acid, NAA (0.1, 1 and 1.5 mg.L
-1
). With
leaf segments, the lowest browning incidence, the greatest callogenesis and the
highest number of shoots were obtained with the media containing 1.5 mg.L
-1
BAP and 1 mg.L
-1
NAA. Two mg.L
-1
BAP + 0.1 mg.L
-1
NAA kept the same results
for petiole explants. Intact leaves showed the best results for the three mentioned
262
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Ebrahimzadeh et al. ISSN 2477-9407
treatments with 1 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA. 0.2 mg.L
-1
NAA caused the highest
rooting percentage and the greatest mean data for the number and length of the
roots. Rooted plantlets were transferred to the pots containing 1:1 peat-moss and
perlite. Acclimatization of the plantlets was followed by 90 % of survival rate in
the greenhouse. The protocol employed would be a potent one to present for the
extension section.
Keyword: nodal explants, MS medium, shoot organogenesis, BAP, NAA, leaf
segments.
Resumen
Pelargonium odoratissimum (L.) L’Her es una planta de complejo enraizamiento
y los métodos comunes de propagación mediante esquejes de tallos no presentan
un resultado positivo con esta especie. Acorde a lo anterior, han realizado ensayos
empleando métodos de cultivo de tejidos para la propagación a gran escala de
esta especie de alto valor. Se emplearon: hojas completas, segmentos de hojas y
secciones de pecíolo; derivadas de explantes nodales producidos in vitro para la
optimización de la micropropagación de P. odoratissimum. Las combinaciones de
tratamiento utilizadas fueron: MS y
1
/
2
MS enriquecidos con 6-bencilaminopurina,
BAP (1, 1.5, 2 y 4.5 mg.L
-1
) y ácido naftalenacético, NAA (0.1, 1 y 1.5 mg.L
-1
). Al
utilizar segmentos foliares, se observó menor incidencia de pardeamiento y mayor
callogénesis. El mayor número de brotes se obtuvo con el medio de cultivo que
contenía 1,5 mg.L
-1
BAP y 1 mg.L
-1
NAA. Los medios de cultivo de 2 mg.L
-1
BAP +
0.1 mg.L
-1
NAA, presentaron los mismos resultados para los explantes de peciolo.
Las hojas completas mostraron los mejores resultados el emplear el medio de 1
mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA. El tratamiento de 0.2 mg.L
-1
NAA causó el mayor
porcentaje de enraizamiento y la mayor media de datos para el número y longitud
de raíces. Las plántulas enraizadas se transrieron a materas utilizando como
sustrato una mezcla de turba-musgo y perlita, con una relación de mezcla 1:1. El
acondicionamiento de las plántulas presentaron una tasa de superviviencia 90 %
en el invernadero. El protocolo empleado presento altas tasas de efectividad como
medio de propagación para su extensión.
Palabras clave: explantes nodales, MS, organogénesis de brotes, BAP, NAA,
segmentos foliares.
Resumo
Pelargonium odoratissimum (L.) L’Her é uma planta de enraizamento difícil e
os métodos comuns de propagação por meio de estacas não têm sucesso com esta
espécie. Portanto, métodos de cultura de tecidos têm sido experimentados para
a propagação em massa desta espécie de alto valor. Folhas intactas, segmentos
foliares e seções de pecíolo derivados de explantes nodais in vitro foram
empregados para a otimização da micropropagação de P. odoratissimum. As
combinações de tratamento utilizadas foram meio MS e
1
/
2
MS suplementado com
6-benzilaminopurina, BAP (1, 1,5, 2 e 4,5 mg.L
-1
) e ácido 1-naftalenoacético, NAA
263
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Ebrahimzadeh et al. ISSN 2477-9407
(0,1, 1 e 1,5 mg.L
- 1
). Nos segmentos foliares, a menor incidência de escurecimento,
a maior calogênese e o maior número de brotações foram obtidos com os meios
contendo 1,5 mg.L
-1
de BAP e 1 mg.L
-1
de ANA. Dois mg.L
-1
de BAP + 0,1 mg.L
-1
de NAA mantiveram os mesmos resultados para explantes de pecíolo. As folhas
intactas apresentaram os melhores resultados para os três tratamentos citados
com 1 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
ANA. 0,2 mg.L
-1
NAA causou a maior porcentagem
de enraizamento e os maiores dados médios para o número e comprimento das
raízes. As plântulas enraizadas foram transferidas para vasos contendo turfa-
musgo 1: 1 e perlita. A aclimatação das mudas foi acompanhada por 90% de
sobrevivência em casa de vegetação. O protocolo empregado seria potente para
apresentar para a seção de extensão.
Palavras-chave: explantes nodais, meio MS, organogênese caulinar, BAP, NAA,
segmentos foliares.
Introduction
Pelargonium odoratissimum (L.)
L’Her. belongs to the Geraniaceae
family (Hassanein and Dorion, 2005).
Essential oil of this species is widely
used in fragrance, hygienic and
cosmetic industries. Furthermore,
the oil holds antimicrobial, antifungal
and insecticidal activities (Gupta
et al., 2002). P. odoratissimum is
considered a hard-to-root species that
is not successfully multiplied when
methods of propagation via stem
cuttings, commonly used in other
Pelargonium species, are applied
(Bhuse et al, 2003). Therefore, tissue
culture methods have been completed
for the mass-propagation of this
high-valued species (Gupta et al.,
2002). Diverse plant organs have
been utilized as micropropagation
propagules (Gupta et al., 2002). Shoot
organogenesis has been successful
with different Pelargonium species via
direct (Dunbar and Stephens, 1989)
or indirect (callogenesis) procedures
(Boase et al., 1998;
Agarwal and
Introducción
Pelargonium odoratissimum
(L.) L’Her. pertenece a la familia
Geraniaceae (Hassanein y Dorion,
2005). El aceite esencial de esta
especie es ampliamente utilizado en
las industrias de fragancias, higiene
y cosméticos. Adicionalmente el
aceite, se le atribuye propiedades
antimicrobianas, antifúngicas e
insecticida (Gupta et al., 2002).
Pelargonium odoratissimum se
considera una especie de complejo
enraizamiento y bajo éxito en los
métodos de propagación a través
de esquejes de tallo, empleados
comúnmente en otras especies de
Pelargonium (Bhuse et al, 2003).
Esta problemática, ha generado el
desarrollo de métodos de cultivos de
tejidos para la propagación masiva de
esta especie de alto valor industrial
(Gupta et al., 2002). Diversos órganos
vegetales se han utilizado como
propágulos en micropropagación
(Gupta et al., 2002). La organogénesis
del brote ha tenido éxito con
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Ebrahimzadeh et al. ISSN 2477-9407
Ranu, 2000). Wojtania et al.
(2004) reported the highest shoot
organogenesis from petiole segments
in ‘Bonete’ (a hybrid of Pelargonium
× hederaefolium) using a medium
containing 2 mg.L
-1
Thidiazuron
(TDZ) and 0.1 - 0.2 mg.L
-1
indole-
3-butyric acid (IBA). Furthermore,
shoot proliferation from leaf and
petioles of P. graveolens was
achieved in the Linsmaier and Skoog
(LS) medium enriched with 1 mg.L
-
1
of 1-naphthaleneacetic acid (NAA)
and 5 mg.L
-1
of 6-benzylaminopurine
(BAP) (Ghanem et al., 2008). In
another study, Hassanein and Dorion
(2005) reported that 1 mg.L
-1
Zeatin +
1 mg.L
-1
BAP + 0.5 mg.L
-1
NAA were
the growth regulator combination
for the highest shoot organogenesis
rate in P. graveolens cv. “Bois joly”.
Regarding root organogenesis, the
highest rooting percentage was
induced on half-strength Murashige
y Skoog (MS) medium supplemented
with 1 mg.L
-1
indolacetic acid (IAA)
(Hassanein and Dorion, 2005). Rao
(1994) documented that 0.1 mg.L
-1
NAA was the best treatment for
the optimum rooting treatments in
Pelargonium. In another study, 90
% of the shoots produced roots after
15 days on a medium containing 0.1
mg.L
-1
IBA (Tembe and Deodhar,
2010). Moreover, Desilets et al. (1993)
reported that the roots emerged
easily in a hormone free
1
/
2
strength
MS medium. The main purpose of
the present study was to formulate
an efcient in vitro propagation
protocol for P. odoratissimum from
leaf and petiole sections and intact
leaf.
diferentes especies de Pelargonium
a través de procedimientos directos
(Dunbar y Stephens, 1989) o
indirectos (callogénesis) (Boase et
al., 1998; Agarwal y Ranu, 2000).
Wojtania et al. (2004), reportaron
la mayor organogénesis de brotes a
partir de segmentos de pecíolos en
‘Bonete’ (un híbrido de Pelargonium
X hederaefolium) empleando un medio
de cultivo de: 2 mg.L
-1
Tidiazuron
(TDZ) y 0,1 - 0,2 mg.L
-1
de acido
indobutírico (IBA). Otros estudios,
obtuvieron proliferación de brotes
de hojas y pecíolos de P. graveolens
empleado medio enriquecido de
Linsmaier y Skoog (LS) con 1 mg.L
-1
acido 1-naftaleacético (NAA) y 5 mg.L
-1
6-benzilaminopurina (BAP) (Ghanem
et al., 2008). Hassanein y Dorion
(2005) obtuvieron que 1 mg.L
-1
Zeatin
+ 1 mg.L
-1
BAP + 0,5 mg.L
-1
NAA,
fue la combinación de reguladores
de crecimiento para obtener la tasa
más alta de organogénesis de brote
en P. graveolens cv. “Bois joly”. En
cuanto a la organogénesis de la raíz,
el porcentaje de enraizamiento más
alto se indujo con el medio de cultivo
Murashige y Skoog (MS) a la mitad
de su concentración suplementado
con 1 mg.L
-1
ácido indolacético (IAA)
(Hassanein y Dorion, 2005). Rao
(1994) documentó que 0,1 mg.L
-1
NAA fue el mejor tratamiento para
los tratamientos de enraizamiento
óptimos en pelargonio. En otro estudio,
el 90 % de los brotes produjeron raíces
después de 15 días en un medio con
contenido de 0,1 mg.L
-1
IBA (Tembe
y Deodhar, 2010). Por otra parte,
Desilets et al. (1993) concluyo que
las raíces emergieron fácilmente en
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Materials and methods
Plant material and supercial
sterilization
Intact leaves, petiole and leaf
segments were chosen from in vitro
derived shoots. In vitro mother plants
were initiated from nodal-cuttings
excised from plants grown in a
greenhouse. Supercial sterilization
of nodal cuttings was completed
in a laminar-airow cabinet as
followed: immersion in 70 % ethanol
for one minute, followed by sodium
hypochlorite 15 % containing 2 drops
of Triton X-100 for 13 minutes.
Thereafter, the explants were three-
times rinsed in distilled water and
then were treated with 70 % alcohol
for 20 seconds. The nodal cuttings
were cultured in Murashige and Skoog
(MS) (Murashige and Skoog, 1962)
medium, and after about one month,
the new shoots were chosen for the
current study explants.
Media and shoot proliferation
The basal medium was MS
supplemented with 3 % sucrose, 0.7 %
agar and 500 mg.L
-1
myo-inositol. Leaf
and petiole segments were cut into 0.5
cm sections under a laminar airow
cabinet. Intact leaf samples were leaves
with about 1 cm in diameter. The
explants were cultured in
1
/
2
strength
MS medium containing BAP (1, 1.5,
2 and 4.5 mg.L
-1
) and NAA (0.1, 1 and
1.5 mg.L
-1
) as treatment combinations.
To prevent tissue browning 50 mg.L
-1
ascorbic acid was added to the medium.
Medium pH was adjusted at 5.6 - 5.7
before autoclaving at 121
ºC
for 20
minutes. Three explants were placed
in each 9-cm petri-dish. The cultures
un medio de cultivo de
1
/
2
MS libre
de hormona. El objetivo principal
del presente estudio fue formular
un protocolo de propagación in vitro
eciente para P. odoratissimum
empleando secciones de hojas y
pecíolos, y hojas completas.
Material y métodos
Material vegetal y esterilización
supercial
Las hojas completas, las secciones
de pecíolo y de hojas fueron elegidos
de brotes cultivados in vitro. Las
plantas madre cultivadas in vitro
provienen de cortes nodales de
plantas cultivadas en invernadero. La
esterilización supercial de esquejes
nodales se realizó en una cabina
laminar con ujo de aire empleando:
inmersión en etanol al 70 % durante
un minuto, seguida de hipoclorito
sódico 15 % que contiene 2 gotas de
Tritón X-100 durante 13 minutos. A
partir de entonces, los explantes se
limpiaron tres veces en agua destilada
y posteriormente fueron tratados con
70 % de alcohol durante 20 segundos.
Los esquejes nodales se cultivaron en
el medio de Murashige y Skoog (MS)
(Murashige y Skoog, 1962), y después
de aproximadamente un mes, los
nuevos brotes fueron elegidos para los
explantes de estudio actuales.
Medio de cultivo y proliferación
de brotes
El medio inicial fue el MS
suplementado con 3 % de sacarosa,
0,7 % de agar y 500 mg.L
-1
mioinositol.
Los segmentos de hojas y pecíolos
se cortaron en secciones de 0,5 cm
bajo una
cabina de ujo laminar.
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were placed under dark conditions
for two weeks, followed by 16:8 hour
photoperiod regime at 23 ± 1
º
C and 20 ±
1
º
C, respectively.
Four weeks after the explants
were initiated, crispy and creamy calli
developed. Callus formation percentage
was measured for each explant.
Calli were sub-cultured on the above
described medium means MS + all BAP
and NAA combinations. Two weeks
later, shoots noticed. About two more
weeks later, the number and length of
the shoots were recorded.
Rooting
The shoots (3 - 4 cm) were excised
and placed on
1
/
2
strength MS medium
containing 0.1 or 0.2 mg.L
-1
NAA and 2
mg.L
-1
active charcoal. The number and
length of the roots were recorded two
weeks later.
Acclimatization
After removing the adhered agar
from the roots using 50
º
C water,
the rooted shoots (3 - 4 cm) were
transferred to the pots containing 1:1
peat - moss: perlite. Rooted cuttings
were placed in growth chambers with
16:8 photoperiod at 23 ± 1
º
C and 20 ±
1
º
C, respectively
.
Statistical analysis
This experiment was conducted
as factorial experiments arranged
in a complete block design with
18 treatment combinations (3
explant types × 6 Plant Growth
Regulator (PGR) combinations) with
5 replications in each experimental
unit. Each experiment was repeated at
least twice and the reported data are
the means of two experiments. Data
analyses was performed using IBM
SPSS software (version 21) (SPSS,
Las muestras de hojas intactas
correspondían aproximadamente
a hojas de 1 cm de diámetro. Los
explantes se cultivaron en un medio de
1
/
2
MS que contenía combinaciones de
BAP (1; 1,5; 2 y 4,5 mg.L
-1
) y NAA (0,1;
1 y 1,5 mg.L
-1
) como tratamientos. Para
prevenir el pardeamiento de tejidos,
se añadió 50 mg.L
-1
de ácido ascórbico
al medio. El pH de medio se ajustó a
5,6 - 5,7 antes de autoclavado a 121°C
durante 20 minutos. Se colocaron tres
explantes de 9 cm en cada placa de
Petri bajo condiciones de oscuridad
durante dos semanas, seguidas por un
régimen de fotoperiodo de 16:8 horas a
23 ± 1°C y 20 ± 1°C, respectivamente.
Cuatro semanas después de
que se iniciaran los explantes, se
desarrollaron callos crujientes y
cremosos. Se midió el porcentaje
de formación del callo para cada
explante. Los callos fueron sub-
cultivados en cada medio de
cultivo o tratamiento descrito
anteriormente (MS + combinaciones
de BAP y NAA). Dos semanas
después, se evidenciaron brotes que
posteriormente a las dos semanas
más tarde, se registraron el número
y la longitud de los brotes presentes.
Enraizamiento
Los brotes (3 - 4 cm) fueron
extraídos y colocados en un medio de
1
/
2
MS que contiene 0,1 o 0,2 mg.L
-1
NAA y 2 mg.L
-1
de carbón activado.
El número y la longitud de las raíces
se registraron dos semanas más
tarde.
Aclimatación
Después de retirar el agar
adherido de las raíces usando agua a
50°C, los brotes enraizados (3 - 4 cm)
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2012). Mean comparison were carried
out by LSD at 5 % probability level.
Results and discussion
Callogenesis
Calli developed from the
explants incubated in the dark
during 4 weeks on
1
/
2
strength MS
medium supplemented with BAP
and NAA at different concentration
combinations. ANOVA results
showed that PGR combinations
(BAP + NAA) as well explant type,
and their interactions affected the
callogenesis, signicantly (p<0.01).
The results showed that intact leaf
explants with 1.5 mg.L
-1
BAP + 1
mg.L
-1
NAA, petiole explants with 2
mg.L
-1
BAP + 0.1 mg.L
-1
NAA, all three
explant types with 1.5 mg.L
-1
BAP + 1
mg.L
-1
NAA treatment combinations
as well as the intact leaf and leaf
segments with 4.5 mg.L
-1
BAP + 1
mg.L
-1
NAA treatment had maximum
callus percentage but there was not
signicant difference among them
(table 1). Therefore, the 1.5 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA combination
would be an appropriate treatment
for callus proliferation in this
species regardless the explant type.
Callogenesis is dependent upon the
internal and external concentrations
of PGRs (Benazir et al., 2013). So,
a suitable concentration of auxins
and cytokinins is necessary to
have reasonable callus formation
as initial in vitro propagation
stage. In Pelargonium rapaceum,
Sukhumpinij et al. (2010) reported
that callus production was optimum
using leaf explants in a medium
se sembraron en macetas con sustrato
1:1 turba - musgo: perlita. Los esquejes
enraizados se colocaron en cámaras de
crecimiento con fotoperiodo 16:8 a 23 ±
1°C y 20 ± 1°C, respectivamente.
Análisis estadístico
Este experimento se llevó a cabo
como factorial de bloques al azar de
18 tratamientos (3 tipos de explantes
× 6 combinaciones de reguladores
de crecimiento vegetal (PGR))
con 5 repeticiones en cada unidad
experimental. Cada experimento se
repitió dos veces y los datos obtenidos
son la media de dos experimentos. Los
análisis de datos se realizaron utilizando
el software IBM SPSS (versión 21)
(SPSS, 2012). La comparación media
se llevó a cabo por LSD en un nivel de
probabilidad del 5 %.
Resultados y discusión
Callogénesis
Los callos se desarrollaron a
partir de los explantes incubados
en la oscuridad durante 4 semanas
en medio de
1
/
2
MS suplementado
con BAP y NAA en diferentes
combinaciones de concentración. Los
resultados de ANOVA mostraron
que las combinaciones de PGR (BAP
+ NAA) así como el tipo de explante,
y sus interacciones afectaron a
la callogénesis, signicativamente
(p<0.01). Los resultados mostraron
que los explantes de hojas completas
con 1,5 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA,
explantes de pecíolo con 2 mg. L
-1
BAP
+ 0,1 mg.L
-1
NAA, los tres tipos de
explantes con 1.5 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA combinaciones de tratamientos,
así como los segmentos de hoja y
268
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enriched with 0.1 mg.L
-1
BAP + 0.1
mg.L
-1
NAA. Furthermore, Gharib
(2005) demonstrated that callus
formation and organogenesis in
Table 1. Mean comparison for the effects of explant type and BAP-NAA
combinations on callogenesis and shoot organogenesis in
Pelargonium odoratissimum.
Cuadro 1. Comparación de los efectos de las combinaciones de tipo de
explante y BAP-NAA en la callogénesis y organogénesis de
broto en Pelargonium odoratissimum.
Study factor Means
Explant
BAP
mg.L
-1
NAA
mg.L
-1
Browning
(%)
Callogenesis
(%)
Mean shoot
number
Mean shoot
length(cm)
Intact leaf 1 1 32.3
efg
100
a
15
ab
2.5
abc
Intact leaf 1.5 1 16.3
g
100
a
10.6
cd
3
ab
Intact leaf 1.5 1.5 15.3
g
86.4
abc
12.5
bcd
3.194
a
Intact leaf 2 0.1 39.9
def
73.6
bcd
8.16
de
2.1
bcd
Intact leaf 2 1 22.9
fg
100
a
13.84
bc
3
ab
Intact leaf 4.5 1 28.6
efg
93.2
ab
8.9
cde
3.46
a
Leaf segments 1 1 71
abc
39.6
fg
2.1
f
0.9
ef
Leaf segments 1.5 1 12.3
g
100
a
19.92
a
3
ab
Leaf segments 1.5 1.5 73
abc
36
fg
2
f
0.55
ef
Leaf segments 2 0.1 42.64
def
79
abcd
9.16
cde
2.5
abc
Leaf segments 2 1 46.5
dc
66.58
cde
5.29
ef
2
cd
Leaf segments 4.5 1 33.3
efg
100
a
11.7
bcd
2.42
abc
petiole 1 1 58.9
bcd
73b
cd
4.36
ef
1.2
def
petiole 1.5 1 40.6
def
93.2
ab
2.78
f
1.35
de
petiole 1.5 1.5 79.3
ab
45.6
efg
1.78
f
0.456
ef
petiole 2 0.1 15.3
g
100
a
19.1
a
3.3
a
petiole 2 1 92.6
a
25.32
g
0.66
f
0.21
f
petiole 4.5 1 56.38
cd
59.6
def
2
f
1.12
ef
Different letters indicate signicant difference within each column based on LSD test at p<0.05;
NAA = 1-naphthaleneacetic acid; BAP = 6-Benzylaminopurine.
Diferentes letras indican una diferencia signicativa dentro de cada columna basada en la prueba
de LSD en p<0.05; NAA = 1-Acido naftalenacético; BAP = 6-Benzilaminopurina.
hoja completa con 4,5 mg.L
-1
BAP + 1
mg.NAA L
-1
presentaron porcentajes
máximos de formación de callos,
pero no había diferencia signicativa
269
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P. nervosum occurred on a medium
supplemented with 5 mg.L
-1
BAP +
1 mg.L
-1
NAA.
For the prevention of explant
browning in vitro, the culture
media was supplemented with 50
mg.L
-1
ascorbic acid. Desilets et al.
(1993) reported that in P. hortorum,
browning was reduced by using half
concentration of macro-nutrients and
lower concentration than 2.2 mg.L
-1
of BAP and NAA. Table (1) shows
that the lowest browning rate in leaf
segments was achieved in the medium
containing 1.5 and 4.5 mg.L
-1
BAP +
1 mg.L
-1
NAA with petiole, 2 mg.L
-1
BAP + 0.1 mg.L
-1
NAA and, in intact
leaf samples all the BAP and NAA
combinations excluding 2 mg.L
-1
BAP + 0.1 mg.L
-1
NAA had the least
percentage of explants with browning.
In short, results showed that the
intact leaf as well leaf segments
slightly affected by oxidation process,
whereas, petiole explants was more
susceptible to oxidation. Arshad et
al. (2012) reported that the highest
survival rate in P. capitatum was
obtained in the medium containing 2
mg.L
-1
BA + 1 or 2 mg.L
-1
NAA. Saxena
et al. (2000) reported that using 0.5
mg.L
-1
BAP instead of kinetin + 0.1
mg.L
-1
NAA increased the survival
rate in P. graveolens leaf explants.
Conversely, 1,5 and 2 mg.L
-1
BAP + 1,5 and 1 mg.L
-1
NAA with
petiole explants and 1 and 1,5 mg.L
-
1
BAP and NAA with leaf segments
possessed the highest browning rate
and hence, imposed negative effects on
the growth and development of shoots
and greatly reduced the survival
rate. Overall, with all used PGR
entre ellos (cuadro 1). Por lo tanto,
el 1,5 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA
combinación sería un tratamiento
adecuado para la proliferación de callos
en esta especie independientemente
del tipo del explante. La callogénesis
depende de las concentraciones
internas y externas de los PGR
(Benazir et al., 2013). Por lo tanto, una
concentración adecuada de auxinas y
citoquinas es necesaria para tener
una formación razonable de callos
como etapa inicial de propagación
in vitro. En Pelargonium rapaceum,
Sukhumpinij et al. (2010) informaron
que la producción de callos era óptima
utilizando explantes de hojas en un
medio enriquecido con 0,1 mg.L
-1
BAP
+ 0,1 mg.L
-1
NAA. Además, Gharib
(2005) demostró que la formación
del callos y la organogénesis en P.
nervosum ocurrieron en un medio
complementado con 5 mg.L
-1
BAP + 1
mg.L
-1
NAA.
Para la prevención del
pardeamiento en los explantes
in vitro, los medios de cultivo se
complementaron con 50 mg.L
-1
de
ácido ascórbico. Desilets et al. (1993)
informaron que en P. hortorum, el
pardeamiento se redujo mediante
el uso de la concentración media de
macronutrientes y una concentración
menor que 2,2 mg.L
-1
de BAP y NAA.
El cuadro (1) muestra
que la tasa de
pardeamiento más baja en los segmentos
de hoja se alcanzó en el medio que contiene
1,5 y 4,5 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA con
pecíolo, 2 mg.L
-1
BAP + 0,1 mg.L
-1
NAA
y, en las muestras de hojas completas,
todas las combinaciones de BAP y
NAA, excepto 2 mg.L
-1
BAP + 0,1
mg.L
-1
NAA tenía el menor porcentaje
270
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combinations, intact leaf samples had
the highest survival rate. This is the
rst report of using intact leaves from
in vitro propagules. It seems that the
great callus proliferation potential
and survival rate of intact leaf might
be related internal hormonal balance,
the lack of injure to the leaf blade and
hence, the low incidence of oxidation
of phenolic compounds (Skoog and
Miller, 1957).
Shoot proliferation
ANOVA results revealed that the
shoot mean number was affected by
treatments (p<0.01), but shoot mean
length was not signicantly affected
by them. For shoot proliferation
(table 1), the calli derived from all
the explants were sub-cultured on
1
/
2
MS medium supplement by BAP and
NAA combinations. After two weeks,
developing shoots were noticeable.
The
responses in shoot production
were different for the diverse treatment
combinations. Petiole explants cultured
on medium containing 2 mg.L
-1
BAP
+ 0.1 mg.L
-1
NAA, intact leaf on 1
mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA and leaf
segments grown on 1.5 mg.L
-1
BAP
+ 1 mg.L
-1
NAA had the signicantly
highest shoot numbers (19.1, 15, and
19.92, respectively). No signicant
differences were determined among
these treatments. Hassanein and
Dorion (2005) reported the highest
shoot number from the leaf segments
of P. capitatum and P. graveolens
cultured in a
1
/
2
MS medium containing
0.5 mg.L
-1
NAA + 1 mg.L
-1
BAP and
zeatin. Zhou et al. (2007) noted that
leaf segments and petiole explants
produced the high number of shoots
in a medium enriched with 1 mg.L
-1
de explantes con pardeamiento. En
resumen, los resultados mostraron que
los segmentos de hojas completas, así
como los segmentos de hoja ligeramente
afectados por el proceso de oxidación,
mientras que, los explantes de pecíolo
eran más susceptibles a la oxidación.
Arshad et al. (2012) informaron que la
tasa de supervivencia más alta en P.
capitatum se obtuvo en el medio que
contiene 2 mg.L
-1
BA + 1 o 2 mg.L
-1
NAA. Saxena et al. (2000) informaron
que usando 0,5 mg.L
-1
BAP en lugar de
kinetina + 0,1 mg. L
-1
NAA aumentó la
tasa de supervivencia en los explantes
de hojas de P. graveolens.
Por el contrario, 1,5 y 2 mg.L
-1
BAP
+ 1.5 y 1 mg.L
-1
NAA con explantes de
pecíolo y 1 y 1,5 mg.L
-1
BAP y NAA
con segmentos de hoja presentaron
la tasa de pardeo más alta y por
lo tanto, efectos negativos en el
crecimiento y desarrollo de brotes
y redujo en gran medida la tasa de
supervivencia. En general, con todas
las combinaciones de PGR usadas, las
muestras de hojas completas tenían
la tasa de supervivencia más alta.
Este es el primer informe de uso de
hojas completas en la propagación in
vitro. Parece que el gran potencial
de proliferación del callo y la tasa
de supervivencia de la hoja intacta
podrían estar relacionados con el
equilibrio hormonal interno, la falta
de daño a la hoja y, por lo tanto,
la baja incidencia de oxidación de
compuestos fenólicos (Skoog y Miller,
1957).
Proliferación de brotes
Los resultados de ANOVA
revelaron que el promedio de brotes
se vió afectado por los tratamientos
271
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BAP + 1 mg.L
-1
NAA. However, due to
our results, it seems that intact leaves
yielded more mean shoot number in
proliferation of P. odoratissimum.
According to the ndings of Zuraida
et al. (2013), using 3-5 mg.L
-1
BAP
reduced the shoot proliferation in
Pelargonium species. Therefore, for
the suitable proliferation, we need a
dened concentration of cytokinins.
According to table 1 petiole developed
the shortest shoots on all PGR
combinations except 2 mg.L
-1
BAP + 0.1
mg.L
-1
NAA, shoots from leaf segments
with 1.5, 2 and 4.5 mg.L
-1
BAP + 0.1
and 1 mg.L
-1
NAA and intact leaf
samples in all treatment combinations
except 2 mg.L
-1
BAP + 0.1 mg.L
-1
NAA
had tallest shoots, with no signicant
differences among them. Accordingly,
the longest shoots in leaf sections and
petiole of P. odoratissimum belonged
to the medium containing 1 mg.L
-1
NAA + 5 mg.L
-1
BAP (Ghanem et al.,
2008).
Brown and Charlwood (1986)
demonstrated that the induction and
subsequent elongation of adventitious
shoots were dependent upon the
different factors such as type and
concentration of PGRs especially
auxins and cytokinins. Therefore, high
cytokinin to auxin ratio is the factor
that affects the proliferation and
shoot length in Pelargonium species
(Brown and Charlwood, 1986; Dunbar
and Stephens, 1989). High cytokinin
and low auxin rates led to increased
shoot formation and elongation. Auxin
endogenous rates surely affect the
phenomenon. It has been reported
by former authors where they noted
that high cytokinin rates improves the
(p<0,01), pero la longitud promedio del
brote no se afecta signicativamente
por ellos. Para la proliferación de
brotes (cuadro 1), los callos derivadas
de todos los explantes fueron sub-
cultivados en suplemento medio de
1
/
2
MS por combinaciones de BAP y
NAA. Después de dos semanas, los
desarrollos de brotes se notaron. Las
respuestas en la producción de brotes
fueron diferentes para las diversas
combinaciones de tratamiento. Los
explantes de pecíolo cultivado en medio
de cultivo que contenian 2 mg.L
-1
BAP
+ 0,1 mg.L
-1
NAA, hoja completa y 1
mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA y segmentos
de hoja cultivados y 1.5 mg.L
-1
BAP +
1 mg.L
-1
NAA presentaron el número
de brote signicativamente más altos
(19,1; 15 y 19,92, respectivamente).
No se determinaron diferencias
signicativas entre estos tratamientos.
Hassanein y Dorion (2005) informaron
el número de brotes más alto de los
segmentos de hojas de P. capitatum y P.
graveolens cultivadas en un medio de
1
/
2
MS que contenia 0,5 mg.L
-1
NAA + 1
mg.L
-1
BAP y zeatin. Zhou et al. (2007)
señalaron que los segmentos de hojas
y explantes de pecíolos producían el
alto número de brotes en un medio de
cultivo enriquecido con 1 mg.L
-1
BAP
+ 1 mg.L
-1
NAA. Sin embargo, debido
a nuestros resultados, parece que las
hojas intactas dieron más número
medio de brotes en la proliferación
de P. odoratissimum. Según las
conclusiones de Zuraida et al. (2013),
utilizando 3 - 5 mg.L
-1
BAP redujo la
proliferación de brotes en especies de
Pelargonium. Se puede inferir que,
para la proliferación adecuada, es
necesaria una concentración denida
272
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proliferation and shoot organogenesis.
Moreover, high organogenesis
potential in Pelargonium species
has been reported by using different
explants like leaf and petioles (Dunbar
and Stephens, 1989; Yi Qy et al., 2010).
In our experiment, leaf segments
with 1.5 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA,
petioles with 2 mg.L
-1
BAP + 0.1 mg.L
-1
NAA and intact leaves with 1 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA achieved the
lowest rate of browning, the highest
callus production with the subsequent
greatest shoot number and tallest
shoots.
Rooting and acclimatization
ANOVA (table 2) results revealed
that the rooting related characteristics
such as rooting percentage and
mean number and length of roots
were affected by NAA concentration
(p<0.01). Furthermore, mean number
and length of roots were signicantly
(p<0.01) affected by explant type. Just
Table 2. ANOVA for the effects of NAA on roots characteristics of
Pelargonium odoratissimum explants.
Cuadro 2. ANOVA para los efectos de NAA en las características de raíces
de explantes de Pelargonium odoratissimum.
Mean Squares
Source of variation DF Rooting (%) Mean root number Mean root length
NAA 1 267.27** 248.88** 9.36**
Explant types 2 1.16
ns
39.04** 1.72**
NAA × Explant types 2 41.31
ns
6.25
ns
0.83*
error 81.32 3.21 0.27
CV 12.56 32.37 21.86
** Signicant at p<0.01, * signicant at p<0.05 and ns: non-signicant. NAA = 1-naphthaleneacetic
acid.
** Signicativo en p<0,01; * signicativo en p< 0,05 y ns: no signicativo. NAA = Acido
1-naftalenacético.
de citoquinas. Según la cuadro 1,
pecíolo desarrollado los brotes más
cortos en todas las combinaciones
de PGR excepto 2 mg.L
-1
BAP + 0,1
mg.L
-1
NAA, brotes de segmentos de
hoja con 1,5; 2 y 4,5 mg.L
-1
BAP + 0,1
y 1 mg.L
-1
NAA y muestras de hojas
intactas en todas las combinaciones
de tratamiento excepto 2 mg.L
-1
BAP
+ 0,1 mg.L
-1
NAA, tuvo los brotes más
altos, sin diferencias signicativas
entre ellos. En consecuencia, los
brotes más largos en secciones de
hojas y pecíolos de P. odoratissimum
pertenecían al medio de cultivo que
contenía 1 mg.L
-1
NAA + 5 mg.L
-1
BAP
(Ghanem et al., 2008).
Brown y Charlwood (1986)
demostraron que la inducción y
posterior elongación de brotes
adventicios dependían de los
diferentes factores como el tipo y la
concentración de PGR, especialmente
auxinas y citoquinas. Por lo tanto,
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root length was inuenced (p<0.05)
by the interactions of treatment and
explant type.
Figure 1 shows that rooting
percentage of the shoots derived from
leaf segments, petioles and intact
leaves was about 58 % and 98 % at
0.1 and 0.2 mg.L
-1
NAA, respectively.
NAA concentration suitable for
rooting for all three explants was 0.2
mg.L
-1
Boase et al. (1998), Zhou et
al. (2007) and Zuraida et al. (2013)
reported the same NAA concentration
for the best rooting percentage and
root number in Pelargonium species
as well. Brown and Charlwood (1986)
as well as Ghanem et al. (2008) also
reported that for P. graveolens. For
root number, 0.2 mg.L
-1
NAA was
the best concentration. Among the
explants, intact leaves had the highest
mean root number (table 3).
la alta proporción de citoquina a
auxina es el factor que afecta a la
proliferación y la longitud del brote
en especies de Pelargonium (Brown y
Charlwood, 1986; Dunbar y Stephens,
1989). Las altas de citoquina y bajas
tasas de auxina indujeron un aumento
de la formación y elongación del
brote. Las tasas endógenas de auxina
seguramente afectan el fenómeno.
Algunos autores al observado que
altas tasas de citoquinas mejora la
proliferación y organogénesis del
brotes. Además, se ha noticado un
alto potencial de organogénesis en
especies de Pelargonium mediante
el uso de diferentes explantes como
hojas y pecíolos (Dunbar y Stephens,
1989; Yi Qy et al., 2010). En nuestro
experimento, segmentos de hoja
con 1,5 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA, pecíolos con 2 mg.L
-1
BAP +
Figure 1. Effect of NAA concentration on the percentage of rooting of Pelargonium
odoratissimum in vitro. NAA = 1-naphthaleneacetic acid.
Figura 1. Efecto de concentración de NAA en el porcentaje de enraizamiento de
Pelargonium odoratissimum in vitro. NAA = 1-ácido naftalenacético.
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As an accepted rule in tissue culture
studies, auxin alone or in combination
with small ratios of cytokinins are
necessary for the root primordial
initiation (Zuraida et al., 2013).
Internal hormonal balance is another
major factor that affects the rooting
potential of different explants. Figure
2 also clearly shows that for all explant
types, again 0.2 mg.L
-1
NAA was the
best concentration for the length of
roots. Boase et al. (1998) reported that
increasing NAA concentration up to
0.2 mg.L
-1
improved root formation
in P. odoratissimum. Several former
studies claim that rooting potential in
Pelargonium species is related to the
shoots quality.
Zuraida et al. (2013) showed that
the highest rooting percentage and
number was obtained in a medium
enriched with 0.2 mg.L
-1
IBA + IAA.
Similarly, Zhou et al. (2007) reported
the same concentration of NAA for
the rooting of Pelargonium plants.
As all physiological processes, rooting
potential and its subsequent growth
0,1 mg.L
-1
NAA y hojas completas
con 1 mg.L
-1
BAP
+ 1 mg.L
-1
NAA
presentaron la tasa más baja de
pardeamiento, la mayor producción de
callos con el mayor número de brotes
subsiguiente y los brotes más altos.
Enraizamiento y aclimatación
Los resultados de ANOVA (Cuadro
2) revelaron que las características
relacionadas con el enraizamiento,
como el porcentaje de enraizamiento y el
número medio y la longitud de las raíces
se vieron afectadas por la concentración
de NAA (p<0,01). Además, el número
y la longitud de las raíces se vieron
signicativamente (p<0,01) afectados
por el tipo de explante. La longitud de
la raíz fue inuenciada (p<0,05) por las
interacciones del tratamiento y el tipo
de explante.
La gura (1) muestra que el
porcentaje de enraizamiento de
los brotes derivados de segmentos
foliares, pecíolos y hojas completas
fue de aproximadamente el 58 %
y el 98 % en 0,1 y 0,2 mg.L
-1
NAA,
respectivamente. La concentración de
Table 3. NAA concentration and explant type effects on root number of
Pelargonium odoratissimum in vitro.
Cuadro 3. Efectos de concentración de NAA y tipo de explante en el
número de raíces de Pelargonium odoratissimum in vitro.
NAA concentrations and explant types Root number
0.1 mg.L
-1
NAA 3.50
b
0.2 mg.L
-1
NAA 7.57
a
Leaf segments 4.82
b
Petiole 4.64
b
Intact leaf 7.15
a
Different letters show statistically signicant differences based on LSD test at p <0.05.
Letras diferentes muestran diferencias estadísticas signicativas basadas en la prueba de LSD
en p<0,05.
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Figure 2. NAA concentration effect on root length of Pelargonium odoratissimum in
vitro. NAA = 1-naphthaleneacetic acid.
Figura 2. Efecto de concentración de NAA sobre la longitud de la raíz de Pelargonium
odoratissimum in vitro. NAA = 1-ácido naftalenacético.
and development are dependent
on hormonal balance inside the
plant tissue. It seems that in some
plant organs, the low amount of
internal auxins necessitates the use
of compensating concentration of
exogenous auxins.
Generally, root number and length
affect the nutrients and water uptake
and hence, hugely inuence the
plantlets establishment and growth.
Finally, healthy rooted plantlets
were selected to transfer to the pots
containing peat-moss: perlite (1:1)
in growth chambers under 16:8
hour photoperiod under 23 ± 1
º
C
and 20 ± 1
º
C
regime. One month
later, the number of survived plants
were recorded. Acclimatization was
completely successful with 90 % of
transferred plants were adapted to
the greenhouse conditions.
NAA adecuada para el enraizamiento
de los tres explantes fue de 0,2 mg.L
-1
.
Boase et al. (1998), Zhou et al. (2007)
y Zuraida et al. (2013) informaron
también la misma concentración de
NAA para el mejor porcentaje de
enraizamiento y el número de raíces
en las especies de Pelargonium.
Brown y Charlwood (1986) así
como Ghanem et al. (2008) también
informaron que en P. graveolens. para
el número de raíz, 0,2 mg.L
-1
NAA
fue la mejor concentración. Entre los
explantes, las hojas completas tenían
el número medio más alto de raíces
(cuadro 3).
Como regla aceptada en los
estudios de cultivo de tejidos, la
auxina sola o en combinación con
pequeñas proporciones de citoquinas
son necesarias para la iniciación
primordial de la raíz (Zuraida et
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Conclusion
This study was conducted to
establish an efcient micropropagation
protocol for P. odoratissimum. The
overall results showed that in vitro
derived intact leaf explants were
superior to the other two explants
(petiole and leaf segments), when
considering their higher callus,
shoot and root organogenesis and
proliferation potential. Nonetheless,
the BAP-NAA combination rates
determined to alarge extent the
organogenesis potential. The highest
callogenesis and shoot organogenesis
were recorded for intact leaves on MS
medium supplemented with 1 mg.L
-1
BAP + 1 mg.L
-1
NAA, with similar
results for leaf segments when grown
on 1.5 and 1 mg.L
-1
BAP and NAA,
respectively, whereas petioles required
2 mg.L
-1
BAP and 0.1 mg.L
-1
NAA
to bring out similar organogenesis.
Acclimatization was 90 % successful
under greenhouse conditions.
al., 2013). El equilibrio hormonal
interno es otro factor importante que
afecta el potencial de enraizamiento
de diferentes explantes. La gura 2
también muestra claramente que para
todos los tipos de explantes, de nuevo 0,2
mg.L
-1
NAA fue la mejor concentración
para la longitud
de las raíces. Boase et
al. (1998) informaron que el aumento
de la concentración de NAA hasta 0,2
mg.L
-1
mejoró la formación de raíces
en P. odoratissimum. Varios estudios
anteriores arman que el potencial
de enraizamiento en especies de
Pelargonium está relacionado con la
calidad de los brotes.
Zuraida et al. (2013) mostraron
que el mayor porcentaje y número
de enraizamiento se obtuvo en un
medio de cultivo enriquecido con
0,2 mg.L
-1
IBA + IAA. Del mismo
modo, Zhou et al. (2007) informaron
de la misma concentración de NAA
para el enraizamiento de plantas de
Pelargonium. Como todos los procesos
siológicos, potencial de enraizamiento
y su posterior crecimiento y desarrollo
dependen del equilibrio hormonal
dentro del tejido vegetal. Parece
que, en algunos órganos vegetales,
la baja cantidad de auxinas internas
requiere el uso de la concentración
compensadora de auxinas exógenas.
Generalmente, el número de
raíces y la longitud afectan los
nutrientes y la absorción de agua y,
por lo tanto, inuyen enormemente
en el establecimiento y crecimiento
de las plántulas. Finalmente, se
seleccionaron plántulas de raíces sanas
para trasplantar a las materas que
contienen sustrato de turba-musgo:
perlita (1:1) en cámaras de crecimiento
inferiores a 16:8 horas de fotoperiodo
bajo 23 ± régimen de 1°C y 20 ± 1°C. Un
mes más tarde, se registró el número de
plantas desarrolladas exitosamente.
El acondicionamiento presento valores
altamente signicativos, el 90 % de las
plantas transferidas se adaptaron a
las condiciones de invernadero.
Conclusión
Este estudio se llevó a cabo
para establecer un protocolo de
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micropropagación eciente para
P. odoratissimum. Los resultados
generales mostraron que los
explantes de hojas completas
derivados in vitro eran superiores
a los otros dos explantes (pecíolo y
segmentos foliares), al considerar su
mayor potencial en el desarrollo de
la callosidad, brote, organogénesis
de raíz y proliferación. No obstante,
las tasas de combinación BAP-NAA
determinaron en gran medida el
potencial de organogénesis. Los datos
de mayor resultado en desarrollo
de callogénesis y organogénesis de
brotes se registraron para las hojas
completas en el medio de cultivo MS
suplementado con 1 mg.L
-1
BAP + 1
mg.L
-1
NAA, con resultados similares
para segmentos de foliares cuando
se cultiva en 1.5 y 1 mg.L
-1
BAP y
NAA, respectivamente, mientras
que los pecíolos requirió 2 mg.L
-1
BAP y 0.1 mg.L
-1
NAA para sacar a
la salida organogénesis similar. El
acondicionamiento tuvo éxito en un
90 % en condiciones de invernadero.
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