REDIELUZ-N7VOL1-art5



REDIELUZ

ISSN 2244-7334 / Depósito legal pp201102ZU3769 Vol. 7 N° 1 • Enero - Junio 2017: 51 - 59


EFECTO SINÉRGICO DE LA APLICACIÓN CONJUNTA DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS Y EL ANTICUERPO TRASTUZUMAB SOBRE CÉLULAS TUMORALES QUE SOBRE-EXPRESAN HER2

INVESTIGACIÓN TECNOLÓGICA

INVESTIGACIÓN TECNOLÓGICA

Synergistic effect of magnetic nanoparticles and trastuzumab antibody on tumor cells over- expressing Her2

Anilo Albornoz2, Tatiana Fandiño3, Sarah Briceño4, Jaheli Fuenmayor1

1Laboratorio de Patología Celular y Molecular. Centro de Medicina Experimental. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Caracas, Venezuela. 2Laboratorio de Biología Celular. Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, Maracaibo Venezuela. 3Hospital Oncológico “Padre Machado”. Ministerio del Poder Popular para la Salud. Caracas, Venezuela. 4Laboratorio de Materiales. Centro de Ingeniería de Materiales y Nanotecnología. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Caracas, Venezuela. jfuenmay@ivic.gob.ve


RESUMEN

Los materiales nanoestructurados representan en la actualidad una propuesta atractiva para una gran variedad de aplicaciones biomédicas. Entre ellas, las nanopartículas (NPs) magnéticas tienen aplicaciones potenciales en el diagnóstico y tra- tamientos de tumores, gracias a su capacidad de ser retenidas en la vasculatura tumoral y de poder ser detectadas usando resonancia magnética. En particular, las NPs de ferrita de cobalto con Azul de Prusia tienen además, aplicación potencial en el campo de la hipertermia y la imagenología por ul- trasonido. Por otro lado, estas propiedades pueden ser combinadas con las de agentes terapéuticos tales como los anticuerpos, los cuales le imprimen mayor especificidad por el tumor. En el presente trabajo, se trataron células de cáncer de mama que sobre-expresan el antígeno tumoral HER2 con una combinación del anticuerpo terapéutico trastuzu- mab y NPs de Azul de Prusia y ferrita de cobalto. La aplicación conjunta de estos agentes produjo un efecto evidente sobre el número de células vi- vas en el cultivo – medida en términos de número de células y permeabilidad al Bromuro de Etidio –, así como cambios en el pH del citoplasma celular detectados con el cromógeno vital naranja de acri- dina, empleando la técnica de microscopía de fluo- rescencia.


Recibido: 17/06/2017. Aceptado: 18/10/2017

Estos cambios son sugestivos de daños en la fisiología de la célula tumoral que podrían estar in- volucrados con su muerte prematura, y que pueden evidenciar un efecto sinérgico de la aplicación con- junta de las nanopartículas con el anticuerpo.

Palabras clave: pH celular; anticuerpo terapéu- tico; cáncer de mama; permeabilización lisosomal

ABSTRACT

Nanostructured materials represent an attractive proposal for a wide variety of biomedical applica- tions. Among them, magnetic nanoparticles (NPs) have potential applications in the diagnosis and treatment of tumors, thanks to their ability to be re- tained in the tumor vasculature and to be detected using magnetic resonance. In particular, the cobalt ferrite NPs with Prussian Blue also have potential application in the field of hyperthermia and ultra- sound imaging. On the other hand, these properties can be combined with those of therapeutic agents such as antibodies, which give it greater specifici- ty for the tumor. In the present work, breast cancer cells that overexpress the HER2 tumor antigen were treated with a combination of the therapeutic anti- body trastuzumab and NPs of Prussian Blue and cobalt ferrite. The joint application of these agents produced an evident effect on the number of live cells in the culture - measured in terms of cell num- ber and permeability to Ethidium Bromide -, as well as changes in the pH of the cell cytoplasm detected with the vital orange chromogen of acridine, using the technique of fluorescence microscopy. These

changes are suggestive of damages in the physio- logy of the tumor cell that could be involved with its premature death, and that may show a synergistic effect of the joint application of the nanoparticles with the antibody.

Keywords: cellular pH; therapeutic antibody; breast cancer; lysosomal permeabilization

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, diversos estudios se han centrado en el uso potencial de nanopartículas (NPs) como alternativas en el diagnóstico y trata- miento del cáncer. Estos estudios han planteado grandes expectativas ya que las nanopartículas magnéticas muestran características prometedo- ras para las aplicaciones biomédicas, incluyendo el diagnóstico por resonancia magnética (RM), la tera- pia dirigida del cáncer, la hipertermia y la liberación controlada de moléculas anticancerígenas. Adicio- nalmente, las nanopartículas magnéticas pueden combinarse con otras moléculas a nivel nanométri- co para satisfacer diversos enfoques terapéuticos (Creixell, Bohórquez, Torres-Lugo, & Rinaldi, 2011).

La funcionalización de nanoparticulas es una es- trategia usada para aumentar la selectividad al tejido blanco a través de la utilización de biomarcadores. De ser exitoso, este abordaje permitiría saltar los mecanismos de resistencia celular y aumentar la concentración de las NPs en el tejido. Estas estra- tegias incluyen, entre otros, el reconocimiento y la unión a receptores de membrana sobrexpresados en las células blanco. La funcionalización a través de la unión a anticuerpos específicos permite que se puedan unir a antígenos específicos con una alta afi- nidad y especificidad. Para lograr la funcionalización de las nanopartículas se utilizan diferentes estrate- gias que permiten asegurar una unión controlada y preservar la estabilidad y la actividad biológica de las mismas (Fan et al., 2011). En este sentido, la biocon- jugación puede tener lugar mediante interacciones electrostáticas (no covalentes), por enlaces covalen- tes directos entre la superficie de la NP y el anticuer- po, o mediante el uso de un adaptador de moléculas (Nobs, Buchegger, Gurny, & Allémann, 2004).

La efectividad de las nanopartículas viene modu- ladapor su capacidad de interactuar con las células tumorales. Esta interacción se inicia, primeramen- te, mediante el contacto con la superficie celular y, seguidamente, por los niveles de internalización que pueda sufrir el complejo nanopartícula-recep- tor. Una vez dentro de la célula, los efectos de las

nanopartículas pueden ser variados y requieren de una evaluación in vitro.En el Laboratorio de Ingenie- ría de Materiales del Instituto Venezolano de Inves- tigaciones Científicas (IVIC)se han producido una diversidad de materiales nanoestructurados con potencial uso en biomedicina, tales como las na- nopartículas magnéticas de Azul de Prusia y Ferrita de cobalto. Estas nanopartículas podrían potencial- mente ser utilizada en el diagnóstico y tratamiento de tumores sólidos gracias a sus propiedades in- trínsecas. En el presente trabajo se probó el efecto in vitro de combinarnano partículas de Azul de Pru- sia y Ferrita de cobaltocon el anticuerpo terapéutico anti-HER2 trastuzumab (HERCEPTIN®) sobre una línea celular de cáncer de mama que sobre-expre- sa HER2 (SKBR-3). Para ello, se incubaron las cé- lulas SKBR-3 en presencia o ausencia del anticuer- po y las nanopartículas y se determinó el efecto de su aplicación conjunta sobre el número de células, la internalización del anticuerpo y los niveles de ac- tivación lisosomal.

METODOLOGÍA

Síntesis de las nanopartículas: Las nanopar- tículas de ferrita de cobalto CoFe2O4 se obtuvieron usando el método de descomposición térmica con un tamaño de 5 ± 2 nm y posteriormente se funcio- nalizaron con K3[Fe(CN)6] en condiciones hidroter- micas de reacción a 170°C por 4h para obtener las nanoparticulas híbridas de Azul de Prusia y Ferritas de cobalto con un tamaño promedio de 100 ± 20 nm. La caracterización de las NPs se realizó usan- do un Microscopio Electrónico de Transmisión FEI Spirit (120 Kv).

Cultivo celular y montaje:Se utilizaron células SKBR-3 (adenocarcinoma mamario de origen hu- mano que sobre-expresa HER2), obtenidas comer- cialmente de la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection ATCC, Es- tados Unidos de América), las cuales se desconge- laron y se cultivaron en condiciones de esterilidad, a 37°C en frascos de 25 cm2 de superficie (T-25) en medio de cultivo Mc Coy´s 5A (Gibco) suplementa- do con suero fetal bovino (0,20 Mm); (SFB, Gibco) L-glutamina (250Mm) (Sigma-Aldrich) y una mezcla de antibiótico-antimicótico (10.000 U/mL) (Gibco). Se procedió a crear una superficie de adheren- cia celular en laminillas cubreobjetos previamente esterilizadas, para luego colocarlas en placas de cultivo de 6 pozos. Brevemente, se agregaron 200 μl de Poli-D-Lisina 0.1mg/ml (Sigma) en cada lá- mina cubreobjeto y se dejó 2 horas a temperatura

ambiente. Transcurrido este tiempo, se lavó con tampón fosfato salinoy a cada lamina se le agregó la suspensión celular a razón de 1.000.000 de cé- lulas por láminilla y se incubó a 37°C y 5% CO2. Se le retiró el medio suplementado y se le adicionaron 1000 μl de medio Mc Coy´s sin suplementar para sincronizar el ciclo celular de las células adheridas durante 1 hora a 37ºC, seguido de una incubación con medio suplementado durante 12 horas para su recuperación. Posteriormente, las células fueron tratadas durante 30 minutos a 37°C con anticuerpo trastuzumab-FITC (10 ug/mL), nanopartícula (10 ug/mL) o una combinación de ambas (mezcladas previo a su aplicación al cultivo celular), cuidando de conservar las mismas concentraciones finales en la mezcla.

Tinción de células vivas con bromuro de etidio y naranja de acridina y observación directa: Una vez tratadas, a un juego de células se le adicionó 50 µl de una solución de naranja de acridina y de bromuro de etidio (10 y 50 ug/mL, respectivamen- te) paraser visualizado inmediatamente en un mi- croscopio de epifluorescencia. Otro juego idéntico de célulasfue fijado con gases de Formaldehido al 40% para ser visualizadas posteriormente.

Para el análisis, se tomó una galería de fotos para cada tratamiento,tomando al menos 5 campos por cada tratamiento y 20 células por campo (total 100 células analizadas por tratamiento).

Análisis de fotografías y organización de datos: El análisis de la galería de fotos arriba mencionada se realizó con el programa ImageJ según protocolo (Abràmoff, Magalhães, & Ram, 2004). Se delimita- ron 2 áreas en el citoplasma con una medida de 50x50 (1976 pixeles). Los datos obtenidos fueron trasladados al programa Excel 2016, y se organiza- ron según la longitud de onda: Rojo (R) o verde (V). En los diferentes tratamientos, se procedió a cal- cular el promedio de la densidad de fluorescencia.

Análisis estadístico:Los datos obtenidos fue- ron analizados mediante tablas de contingencia en el programa estadístico GraphPad Prisma 6.

RESULTADOS


Figura 1. Micrografía de nanopartículas de Ferrita de Cobalto y azul de Prusia.


En la figura 1 se muestra una micrografía de las nanopartículas de ferrita de cobalto con azul de prusia donde se aprecia la forma y el tamaño de las mismas. Estas NPs presentan una forma regu- lar esferica, típica de compuestos de azul de prusia preparados bajo las condiciones específicadas en la sección de métodos.

En la Figura 2, se evaluó de forma cualitativa la intensidad de fluorescencia del anticuerpo presente en la membrana de las células incubadas bajo los diferentes tratamientos. Los paneles A y B corres- ponden a células sin tratamiento o tratadas con na- nopartícula solamente, respectivamente. En estas células solo se observa la tinción del núcleo con el marcador azul DAPI y una medición de la au- tofluorescencia emitida por estas células.Dado que la nanopartícula no fluoresce a la longitud de onda utilizada, no es posible observar su presencia en estas micrografías. No obstante, la presencia de la nanopartícula fue confirmada empleando un filtro para campo oscuro en el mismo microscopio (da- tos no mostrados). En los paneles C y D, se puede apreciarla intensidad de fluorescencia verde obser- vada en la membrana de células tratadas con Tras- tuzumab–FITC (TZ-FITC) y Trastuzumab–FITC en presencia delas nanopartículas (TZ-FITC/NP). Como era de esperarse, en los dos tratamientos en los que se adicionó TZ-FITC (con y sin nanopartí- culas) se observa una señal claramente visibleque refleja la cantidad de anticuerpo presente en la cé- lula. De manera cualitativa, puede observarse la presenciaderegiones de mayor intensidad de fluo- rescencia en la membrana de las células tratadas con el anticuerpo que fue previamente mezclado con las nanopartículas.

Con el fin de corroborar lo observado de manera cualitativa, estas imágenes fueron analizadas utili- zando elsofwareImage J (Figura 3). El análisis de estas mediciones a través de tablas de contingen- cia (usando como punto de corte el promedio de la fluorescencia medida en el grupo de Tz-FITC más una desviación estándar) detectó una relación sig- nificativa entre una alta intensidad de fluorescencia en la membrana celular y la presencia de las nano- partículas (Prueba Ji-cuadrado,p= 0,0031).

En la figura 2 también se puede observar la in- tensidad de fluorescencia en el citoplasma y núcleo de estas mismas células para cada tratamiento. En este caso, no se detectan de manera cualitativa di- ferencias algunas.Tampoco se halló una relación positiva entre la intensidad de fluorescencia emitida por el anticuerpo y la presencia de las nanopartícu- las en el citoplasma (Prueba Ji-cuadrado,p=0,3490), nien el núcleo (Prueba Ji-cuadrado,p=0,5854) lue- go del análisis con el programa Image J.


Año 2016

Figura 2. Micrografías de células SKBR3 tratadas con trastuzumab-FITC y/o nanopartículas de ferrita de cobalto y azul de prusia. La coloración azul corresponde al marcaje del ADN del núcleo con DAPI. Panel A(CTL): células sin tratamiento. Panel B(NP): células tratadas con nanopartículas de ferrita de cobalto acoplada a azul de Prusia (10 μg/ml). Panel C(TZ-FITC): células tratadas con Trastuzumab–FITC(10 μg/ml). Panel D(TZ-FITC/NP): células tratadas con Trastuzumab–FITC previamente mezclado connanopartículas de ferrita de cobalto acoplada a azul de

Prusia(ambos a 10 μg/ml).

Intensidad de la fluorescencia


Año 2016

Figura 3. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia verde registrada en la Fig. 2, CTL: células control sin tratamiento. NP: células tratadas con nanopartículas de ferrita de cobalto acoplada a azul de Prusia a 10 μg/ml.TZ- FITC: células tratadas con Trastuzumab–FITC a 10 μg/ml. TZ-FITC/NP: células tratadas conjuntamente con Tras- tuzumab–FITC y nanopartículas a 10 μg/ml.Análisis de la zona de la membrana celular.

La figura 4 muestra el resultado de la evaluación cualitativa del pH citoplasmático y lisosomal de cé- lulas tumorales tratadas o no con las nanoparticulas magnéticas y el anticuerpo humanizado trastuzu- mab. En el panel A, correspondiente a las células sin tratamiento (CTL), se observa un pH esencial- mente neutro en el citoplasma (coloración verde de la naranja de acridina), el cual se equipara con el de la imagen correspondiente a las células tratadas con el anticuerpo Trastuzumab (Panel B, TZ-FITC) y a las tratadas con las nanoparticulas magnéticas (Panel C, NP), por separado. En la imagen corres- pondiente a las células tratadas conjuntamente con las nanoparticulas y el anticuerpo trastuzumab (Pa- nel D, TZ-FITC/NP), se observa una atenuación de la intensidad de fluorescencia verde con un incre- mento concomitante de la coloración naranja en el citoplasma, lo que es indicativo de una disminución del pH citoplasmático por un probable compromiso de la membrana lisosomal. En algunos casos, se observa además una coloración naranja en el nú- cleo celular, que indica el ingreso del bromuro de etidio al núcleo y su enlace al ADN, evidenciando el deterioro de la membrana celular. Otra observación interesante resulta de la disminución del número de

células presentes por campo en el cultivo, el cual se observa significativamente menor en el cultivo tra- tado con la combinación Nanopartículas/anticuerpo (tabla de contingencia, Ji-cuadrado, df: 63,52, 1 con valor de p˂0,05) al ser comparado con cualquiera de las otras condiciones.

En la figura 5 se observa la cuantificación de la intensidad de la señal de fluorescencia verde re- gistrada en citoplasma celular en los diferentes tra- tamientos, luego de la tinción vital con bromuro de etidio y naranja de acridina. El análisis estadístico de estos valores (Tablas de contingencia)arrojó una correlaciónsignificativa entre una baja intensidad de fluorescencia verde en el citosol(menor al promedio del control menos una desviación estándar; Ji-cua- drado, df: 60,62,1con valor de p˂0,05) y el trata- miento conjunto del anticuerpo y la nanopartícula. De esta manera se corrobora que el citoplasma en todas las células tratadas con nanopartículas man- tiene un pH neutro similar al observado en el trata- miento con el anticuerpo solo o en las células sin tratar. Sin embargo, al combinar ambos tratamien- tos, los valores de pH citoplasmático disminuyeron de manera significativa, es decir, el citoplasma se hace más ácido.


Figura 4.Micrografías de células SKBR3 tratadas con trastuzumab-FITC y/o nanopartículas de ferrita de cobalto y azul de prusia, teñidas con Naranja de acridina y Bromuro de Etidio (5 mg/mL).Panel A: células sin tratamiento. Panel B: células tratadas con nanopartículas de ferrita de cobalto acoplada a azul de Prusia (10 μg/ml). Panel C: células tratadas con Trastuzumab–FITC(10 μg/ml). Panel D: células tratadas con Trastuzumab–FITC previamente mezclado con nanopartículas de ferrita de cobalto acoplada a azul de Prusia(ambos a 10 μg/ml).


Figura 5. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia registrada en la Fig. 4, CTR: células control sin tratamiento. TZ: células tratadas con Trastuzumab–FITC a 10 μg/ml. NanoP: células tratadas con nanopartículas de ferrita de cobalto acoplada a azul de Prusia a 10 μg/ml. TZ/NanoP: células tratadas conjuntamente con Tras- tuzumab–FITC y nanopartículas a 10 μg/ml.Se destaca en números rojos el valor del punto de corte usado para los análisis estadísticos por tablas de contingencia.

Este mismo análisis estadístico (Tablas de con- tingencia)empleando los valores de intensidad de fluorescencia en rojo,no mostró correlaciónalguna entre la intensidad obtenida en los diferentes tra- tamientos (Ji-cuadrado df: 0,2211,1con valor de p˃0,05) (datos no mostrados).

Con el fin de registrar de forma más integral el fenómeno observado en el citoplasma celular, se realizó un cociente entre las intensidades de verde y rojo observadas (Figura 6). En los tres primeros casos (CTR, TZ y Nanop), la relación entre la co- loración verde y la roja del citoplasma se mantuvo

cercana a 2. En cambio, bajo el tratamiento con las nanoparticulas y el anticuerpo combinados (Tz-na- nop), este cociente se redujo significativamente a menos de la mitad. Según el análisis estadístico,(Ta- blas de contingencia)existe una correlación entre los cocientes de intensidad de fluorescencia obtenidos y los diferentes tratamientos, siendo el tratamiento- combinado (Tz-nanop)(Ji-cuadrado, df: 63,52,1 con valor de p˂0,05) el que presenta el menor cociente con respecto a las otras tres condiciones.



Figura 6. Cociente entre las intensidades de fluorescencia verde y roja registradas en la Fig. 4, CTR: células control sin tratamiento. TZ: células tratadas con Trastuzumab–FITC a 10 μg/ml. NanoP: células tratadas con nano- partículas de ferrita de cobalto acoplada a azul de Prusia a 10 μg/ml. TZ/NanoP: células tratadas conjuntamente con Trastuzumab–FITC y nanopartículas a 10 μg/ml.

DISCUSION

La toxicidad de las NPs para los humanos y el ambiente resultade absoluta prioridad en nanome- dicina. En este sentido, los cultivos celulares son importantes comoherramienta de primera línea para evaluar la eficacia terapéutica y la seguridad de los medicamentos y de esta manera proporcio- nar información esencial para comprender las inte- racciones célula-nanopartículas, antes de pasar al análisis in vivo(Luengo, Nardecchia, Morales, & Se- rrano, 2013)many questions still arise concerning the biocompatible nature of NPs when in contact with biological systems. Herein, we have investiga- ted how controlled changes in the physicochemical properties of iron oxide NPs at their surface (i.e., surface charge and hydrodynamic size.

La modificación de nanopartículas con compues- tos biológicamente activos permite el transporte de agentes terapéuticos a células diana específicas, aumentando la especificidad y evitando el acceso de agentes citotóxicos a los tejidos que no son ob- jetivo durante el proceso de suministro(Sajja et al., 2009). La orientación activa aprovecha la expresión aumentada de diferentes epítopos o receptores en las células tumorales y/o en características físicas específicas, por lo que los anticuerpos representan uno de los bioconjugados más interesantes para lograr la entrega dirigida activa de un portador tera- péutico(Manuel Arruebo, Fernández-Pacheco, Iba- rra, & Santamaría, 2007). La combinación con an- ticuerpos aprovecha entonces las propiedades de las NPsy la capacidad selectiva de los anticuerpos para antígenos específicos, mejorando la captación celular ybrindando mayor estabilidad intracelular(M Arruebo, Valladares, & Gonzalez-Fernandez, 2009).

A pesar de que en nuestros ensayosno fue po- sible corroborar el acoplamiento entre las nano- partículas magnéticas empleadas y el anticuerpo trastuzumab mediante la visualización con el mi- croscopio de epi-fluorescencia disponible, la combi- nación física entre éstos parece haber sido exitosa. Esto se demuestra al comparar los resultados del tratamiento combinado con los de aquellos en los que se aplicó las nanopartículas o el anticuerpo de forma independiente, ya que en estos últimos no se observaron cambios tan notorios sobre los niveles de fluorescencia o el número de células SKBR-3 vivas en el cultivo.Por lo tanto, es posible que inte- racciones de tipo no-covalente resulten lo suficien- temente fuertes como para que se cree una unión estable(Bertolini, Shaked, Mancuso, & Kerbel,

2006). Según Yu y col. (2012), este tipo de uniones pueden ser bastantes estables y son capaces de generar cambios significativos en la fluorescencia observada en las membranas de células tratadas de forma similar a la aquí descrita. De hecho, la combinación de la nanopartícula magnética de fe- rrita de cobalto y azul de prusia con el anticuerpo trastuzumab favoreció la ubicación una mayor can- tidad del anticuerpo sobre a la membrana, reflejado en un aumento de la fluorescencia superficial(Yu, Park, y Jon 2012).

El aumento de la unión de un anticuerpo dirigido contra el receptor de factor de crecimientoepidérmi- co en presencia de nanopartículas magnéticas ha sido descrito en estudios previos. Hathaway y co- laboradores conjugaron nanopartículas de óxido de hierroa un anticuerpo anti-HER2, demostrando un aumento dependiente de la concentración del an- tígeno y del tiempo, en líneas celulares de cáncer de mama(Hathaway et al., 2011). Adicionalmente, se ha confirmadoexperimentalmente la interacción entre NPs en suspensión y membranas lipídicas(- Drašler et al., 2014).En aplicaciones biomédicas, la localización de nanopartículas en las membra- nas permitiría la identificación de los grupos celula- res o el marcaje de tejidos, bien sea para estudios por imagen o para la realización de cirugía guiada por imágenes(Karakatsanis et al., 2016)p = 0.76. Cuando estas nanopartículas se encuentran bio- funcionalizadas con moléculas como los anticuer- pos, pueden dirigirse más eficientemente a tejidos blanco con base en la sobre-expresión de proteínas específicas, tales como HER2.

El análisis in vitro empleando una mezcla de Na- ranja de Acridina (OA) y Bromuro de Etidio (BrEt) permite la detección simultánea de varios fenóme- nos biológicos en un mismo análisis. Por una par- te, puede registrarse la viabilidad celular median- te el monitoreo de la integridad de la membrana plasmática por exclusión del BrEt. Por otro, puede observarse el efecto del tratamiento sobre el me- canismo de muerte celular y la participación de pro- cesos lisosomales sobre el mismo. Este abordaje ha sido utilizado en la evaluación del efecto cito- tóxico de varias nanopartículas (Nogueira, Mitjans, Rolim, & Vinardell, 2014).

Nuestros resultados muestran que, a las con- centraciones y tiempos empleados, las células tra- tadas con Trastuzumab-FITC o nanopartícula de manera indepediente no presentan un comporta- miento significativamente citotóxico al ser compa- rados con el control sin tratamiento en ensayor de

permeabilidad al bromuro de etidio. En cambio, el tratamiento combinado de nanopartículas con anti- cuerpomuestra un menor número de células adhe- ridas, algunas de las cuales presentan caracterís- ticas que sugieren que hubo una permeabilización de la membrana plasmática y/o lisosomal, obser- vándose rojas en el núcleo y el citoplasma. Estos resultados sugieren que la combinación de la na- nopartícula con el anticuerpo puede tener un efecto sinérgico que afecta la sobrevida celular.Tseng et al (2015) crearon una nanopartícula y la conjugaron covalentemente al anticuerpo Cetuximab, un anti- cuerpo dirigido al receptor de factor epidérmico hu- mano (EGFR) que es sobreexpresado en algunos tipos celulares de cáncer de mama, páncreas y pul- món. En dicha investigación también encontraron que el tratamiento de células tumorales con las na- nopartículas conjugadas al anticuerpo Cetuximab aumenta la muerte celular ypreservando además la capacidad del sistema inmunitario de reconocerlas a través del anticuerpo.

La naranja de acridina es un compuesto per- meable a la célula, el cual se concentra dentro de los lisosomas, dándoles un color naranja que es dependiente del pH ácido característico de esta or- ganela. Cuanto más alta sea la concentración de la naranja de acridina dentro del lisosoma (lo cual depende de su acidez), mayor será su intensidad de fluorescencia roja. En el citoplasma, dondeel pH es normalmente neutro y en consecuencia la concentración de naranja de acridina es baja, se observa normalmente una fluorescencia verde.Con estas simples características es posible evaluar la activación lisosomal de las células tumorales tra- tadas, ya que cualquier cambio en la intensidad de la fluorescencia representa ya sea una activa- ción lisosomal, una acidificación del citoplasma o ambas(Boya P, 2008).

En el caso particular del tratamiento conjunto de nanopartícula y anticuerpo, el incremento de la muerte celular se presenta en un contexto en el que la concentración de anticuerpo sobre la membrana se ve signficativamente aumentada por la presen- cia de la nanopartícula y las células sobrevivientes presentan modificaciones citoplasmáticas que su- gieren la afectación de la función del lisosoma. La disminución del pH citoplasmático sugiere que en- zimas hidrolíticas provenientes del lisosoma hayan podido permearse hacia el citoplasma, afectando la neutralidad del pH.

Este tipo de fenómeno ya ha sido descrito en células tumorales tratadas con ciertos detergentes, con enzimas contenidas en los gránulos de células citotóxicas y otras moléculas capaces de inducir la permeabilización de la membrana lisosomal(Mar- tins et al., 2015)(Zhang, Zhong, Shi, Guo, & Fan, 2009).La relación entre estos dos fenómenos, i.e. una mayor cantidad de anticuerpo sobre la superfi- cie celular y la disminución del pH citoplasmático, no ha sido establecida pero no pareciera depender de la internalización prematura del anticuerpo, ya que a los tiempos estudiados no se observó mayor can- tidad de anticuerpo fluorescente dentro del citosol.

Finalmente, muchos de los estudios realizados con nanopartículas hasta la fecha también inclu- yen ensayos en modelos animales que demues- tran su localización dentro del tumor y su toxicidad, por lo que se sugiere la realización de este tipo de ensayos con las nanopartículas magnéticas con- jugadas a trastuzumab para la evaluación de su potencial terapéutico real.

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